茶叶中杀冥硫磷含量的测定

□ 李州霞 淮南市食品药品检验中心

有机磷农药是农作物种植中广泛应用的农药，杀螟硫磷在有机磷农药中属于毒性中等的农药，杀虫的效果较好，因此也是常用的农药之一，被应用在很多叶片类农作物的生产中。而有机磷农药的大量应用使得因农药残留而中毒的事件在近期频繁发生，因此，研究叶片类农作物中杀螟硫磷含量的测定，对于提升农作物安全性，降低因农药残留导致的中毒事件的发生有很大帮助[1]。

1 BIAcore技术

BIAcore技术是一种利用抗体亲和原理进行检测的技术，而本文中所提及的单链抗体（scFv）在检测核酸和蛋白质等有机物方面具有较强的优势，其组织穿透力更强，且制备的技术成本更低，目前在医学领域中常将此方式用于检测生物大分子，并且效果较好。但目前尚缺乏使用此方式检测农药残留的研究，而根据杀螟硫磷的结构推测，其对单链抗体具备较强的亲和力，因此使用BIAcore技术检测茶叶中的杀螟硫磷残留在理论上是可行的。

2 实验材料和方法

2.1材料

茶叶：云南普洱茶叶若干，包括使用杀螟硫磷的农药样品500 g和未使用任何农药的样品500 g。

仪 器：BIAcore X检 测 系 统、其中包括CM5芯片、蛋白酶标定仪（Model）、蛋白纯化系统（HisLink）。

试剂：HEPES缓冲溶液、卵清白蛋白、含杀螟硫磷的有机磷农药标准检测样品。

2.2 实验方法

2.2.1 单链抗体筛选

单链抗体的筛选分为表达与再筛选两步，其中表达过程中，使用经过核糖体筛选所获得的杀螟硫磷的单链抗体基因，由pPOW载体嫁接后转运到大肠杆菌中，作为批量表达和生产单链抗体的载体。

再筛选过程。选择对杀螟硫磷抗性较强的卵清白蛋白，将之与CM5芯片偶联后，将大肠杆菌所表达的蛋白质溶液注入检测系统中，从而在检测系统中得到与杀螟硫磷亲和力较强的抗体基因。

2.2.2 单链抗体的亲和力

此过程分为纯化和亲和力分析两步，在纯化过程中，将上一步所获得的与杀螟硫磷亲和力较强的抗体基因注入蛋白纯化系统中，得到纯度更高的抗体蛋白。

在亲和力分析中，将纯化后的抗体蛋白使用HEPES缓冲溶液按照不同的浓度梯度比进行稀释，浓度梯度比为 8、4、2 mol/L与 1 mol/L， 将 所得到的溶液注入BIAcore X中，利用与仪器连接的分析软件分析不同浓度的溶液与杀螟硫磷的亲和力。

2.3 单链抗体特异性分析

利用上文中得到的与杀螟硫磷亲和力较强的抗体，将其与含杀螟硫磷的农药和其他种类的有机磷农药结合，分析其余不同种类农药的亲和力，为下一步实验作准备，下一步实验分为酶联免疫分析和半抑制浓度的获得以及交叉反应率计算3步。

2.3.1 酶联免疫分析

此过程利用酶联板进行，首先向酶联板中加入80 μL单链抗体溶液，浓度为18 μg/mL，静置一整夜后，于次日弃用酶联板中的溶液，用磷酸盐缓冲液清洗酶联板后向其中加入不同种类和浓度梯度的有机磷农药，除杀螟硫磷外，还包括对硫磷、毒死蜱、三唑磷等农业生产中常用的有机磷农药。装置在37 ℃下放置2 h后向其中加入硫酸终止反应，使用蛋白酶标定仪读取酶联板中的结合率（OD）值。

2.3.2 IC50的获得

建立坐标系，以有机磷农药的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制不同种类有机磷农药的结合率曲线图，并通过曲线计算IC50。

2.3.3 交叉反应率计算

交叉反应率计算公式见式（1）。

2.4 茶叶中杀螟硫磷的测定

将茶叶捣碎，向其中加入少许丙酮，待溶液与丙酮充分混合后，进行离心分离20 min，取上清液放置备用。

使用磷酸盐缓冲液配制杀螟硫磷的浓度梯度溶液，由0 nmol/L至10 nmol/L，浓度梯度值为2，向其中加入制备好的单链抗体溶液，在室温下静置2 h，待抗体与杀螟硫磷充分结合后，将溶液注入BIAcore X系统中，选取其中包含杀螟硫磷的CM5芯片，读取其响应值，并绘制标准曲线，筛选出其中亲和力较高的抗体基因。

2.4.1 高亲和力单链抗体的筛选

在参与筛选的65个抗体基因中，得到了3个与杀螟硫磷结合性较好的抗体基因，随后对这3个抗体基因的结合速率常数、解离速率常数和解离平衡常数进行了测量，具体结果如表1所示。

在表1中，检测抗体与抗原结合性能的关键指标是解离平衡常数，该数值越小说明抗体与抗原的亲和力越强，从表1中可以看出，抗体ScFv-AF120与杀螟硫磷结合的能力最强，因此下文中将选择此抗体作为实验的对象。

2.4.2 杀螟硫磷含量的测定

选择与杀螟硫磷抗原结合能力最强的抗体ScFv-AF120，将其与备用的上清液充分混合后注入到BIAcore X系统中，利用系统的分析软件以不同质量浓度下的RU值作为纵坐标，以样品溶液中的杀螟硫磷质量浓度参数为横坐标，绘制曲线图，如图1所示。

通过计算图1中的曲线，可以得到RU值的回归方程，利用回归方程，结合样品提取液中的茶叶的质量，可计算出茶叶中杀螟硫磷的含量约为0.124 mg/kg。

表1 3种抗体与杀螟硫磷抗原结合的性能

图1 杀螟硫磷质量浓度标准曲线

国家对蔬菜类农作物中杀螟硫磷的限值规定为0.5 mg/kg，可以看出云南普洱茶中的杀螟硫磷含量低于国家标准，符合质量鉴定的要求。

2.5 样品添加的回收率

向无农药的茶叶样本中加入浓度为0.5、5、50 mg/kg的杀螟硫磷，并进行回收率的检验，结果如表2所示。

表2 n=5时的样品回收率和精密度检验结果

从2中可以看出，样品的回收率在94.5%～101.3%，RSD最大值为2.2%，这说明此方式可以用于检测茶叶中的杀螟硫磷含量。

3 结论

本文采用基于单链抗体的BIAcore法，对茶叶中的杀螟硫磷含量进行了研究，通过对抗体的筛选和特异性分析等步骤得出与抗原结合力最强的抗体，对云南普洱茶茶叶采用此方式进行检测，测得茶叶中的杀螟硫磷质量浓度在0.124 mg/kg，低于国家标准，符合质量要求。此方式的样品回收率在94.5%～101.3%，RSD最大值为2.2%，可以作为实际的检测方案。