华重楼离体胚培养及植株再生初探

陈瑶 周寒梅 何兵 李维

摘 要： 為探明华重楼离体胚培养及植株再生的基本体系，该文以华重楼离体幼胚为试验材料，以MS培养基为基本培养基，研究不同光照、不同浓度梯度组合的植物生长调节剂对华重楼离体幼胚萌发、成苗的影响。结果表明：培养到60 d时，暗培养条件下华重楼离体幼胚的生长率和萌发率分别比光培养条件下高45.25%、19.17%，故暗培养比光培养更有利于华重楼离体幼胚生长发育。当GA3浓度相同时，离体幼胚萌发所需时间随IAA浓度增加而延长。不同浓度的GA3都可促进离体幼胚萌发，促进作用由强到弱依次为5 mg·L-1 GA3>1 mg·L-1 GA3> 10 mg·L-1 GA3。在黑暗条件下，优选得到最适华重楼离体幼胚生长发育配方为1/2 MS+30 g·L-1 蔗糖+7 g·L-1琼脂+0.5 g·L-1 活性炭+5 mg·L-1GA3+1 mg·L-1 IAA。此配方可诱导华重楼离体幼胚在2个月左右萌发，萌发率达50%需80 d左右。在华重楼成熟胚出苗培养时发现，高浓度的植物生长调节剂会抑制华重楼成熟胚生长发育，高浓度GA3甚至会导致华重楼成熟胚死亡。优选得到最适华重楼成熟胚出苗配方为MS+30 g·L-1 蔗糖+6.2 mg·L-1 硼酸+7 g·L-1 琼脂+0.7 g·L-1 活性炭+0.5 mg·L-1 2，4-D+1.5 mg·L-1 IAA + 1.5 mg·L-1 ZT+5mg·L-1 GA3，诱导成熟胚出苗需43 d左右，75 d左右可形成真叶。

关键词： 胚培养， 离体幼胚， 成熟胚， 光照， 植物生长调节剂

中图分类号： Q945

文献标识码： A

文章编号： 1000-3142（2020）11-1681-10

Abstract： Light and plant-growth regulators have a great influence on the regeneration efficiency of somatic embryos and the growth of regenerated plants. In this study， the effects of light and plant-growth regulators on the regeneration of in vitro embryos and the growth of regenerated plants were examined in immature in vitro embryos from Paris polyphylla var. chinensis seeds. The main purpose was to explore the basic system of in vitro embryos culture and growth of regenerated plants in P. polyphylla var. chinensis. In order to study the effects of plant-growth regulators on the growth and development of immature in vitro embryos and the growth of regenerated plants， supplemented with plant-growth regulators with different kinds and concentrations to MS mediums. In order to study the effect of light on the growth and development of immature in vitro embryos of P. polyphylla var. chinensis， the immature in vitro embryos were cultured in light and dark conditions. The results showed that dark conditions were more conducive to the growth and development of immature in vitro embryos in P. polyphylla var. chinensis than light conditions. When cultured for 60 d， the growth rate and germination rate of immature in vitro embryos of P. polyphylla var. chinensis under dark culture conditions were 45.25%， 19.17% higher than those under light culture conditions， respectively. When the concentration of GA3 was the same， the germination time of immature in vitro embryos was prolonged as the concentration of IAA increased. Different concentrations of GA3 promoted the germination of immature in vitro embryos. The promoting effect was 5 mg·L-1  GA3>1 mg·L-1  GA3> 10 mg·L-1  GA3. Under dark conditions， the best formula for immature in vitro embryos of P. polyphylla var. chinensis germination was 1/2 MS + 30 g·L-1 sucrose + 7 g·L-1 agar + 0.5 g·L-1 activated carbon + 5 mg·L-1 GA3+ 1 mg·L-1 IAA. This induced in vitro embryo P. polyphylla var. chinensis germination in about two months. The germination rate reached 50% after about 80 d. In the mature embryos emergence experiment， a high concentration of plant-growth regulators inhibited the growth and development of mature embryos in P. polyphylla var. chinensis. A high concentration of GA3 in particular led to the death of mature embryos. The best formula for seedlings of mature embryos was MS + 30 g·L-1 sucrose + 6.2 mg·L-1 boric acid + 7 g·L-1 agar + 0.7 g·L-1 activated carbon + 0.5 mg·L-1 2，4-D + 1.5 mg·L-1 IAA + 1.5 mg·L-1  ZT + 5 mg·L-1  GA3. Mature embryos could produce seedlings within only 43 d. True leaves were formed after around 75 days.

Key words： embryos culture， immature in vitro embryos， mature embryos， light， plant-growth regulator

华重楼（Paris polyphylla var. chinensis）是我国Ⅱ级保护植物、名贵中药材。重楼中主要活性物质为甾体皂苷，具有抗肿瘤（Huang et al.， 2007;Wu et al.， 2013）、抗菌（Qin et al.， 2012）、抗氧化（张宁，2016）、止血（李洪梅等，2017）等作用。干燥重楼根茎是云南白药、季德胜蛇药片、宫血宁等65种中成药的重要原料（武珊珊等，2004;杨天梅等，2017;张翔宇等，2017）。由于重楼药用功效不断被开发，市场价格不断攀升，导致重楼野生资源遭到无规律、大量的采挖，野生资源急剧减少。20世纪80年代，干燥重楼根茎价格约每千克2.5元（何良艳等，2011），近年来已上涨到每千克400元（赵庭周等，2014）。在巨大经济利益的驱使下，重楼野生资源陷入“越挖越少、越少越贵、越贵越挖”的恶性循环。我国80%的野生重楼已被开发利用（黄希等，2016）。为缓解重楼野生资源困境，必须加快重楼人工繁殖速度。但如何打破重楼种胚形态休眠和生理休眠、提高种子萌发率等方面仍没有取得突破性进展。因此，研究重楼属植物组织培养技术是解决重楼属植物快繁瓶颈的有效途径。不同学者分别以重楼根状茎（熊海浪等，2012;宋发军等，2013;王跃华等，2014;刘银花等，2015b）、茎尖、子房、茎段（李群等，2006）、芽（杨丽云等，2008;王跃华等，2014）、芽轴（刘银花等，2015a）、叶片（熊海浪等，2012;王跃华等，2014）、种胚（熊海浪等，2012;王跃华等，2015）、种子（宋发军等，2013;杨淋等，2013）等为材料建立了重楼组织培养体系，但都存在愈伤组织诱导和增殖率低、幼苗移栽成活率低等问题，实用价值不高。

胚培养是在离体无菌条件和适宜培养基中使离体胚发育成苗的技术（王蒂，2004），且对促进植物育种和遗传学研究具有重要意义（Yao et al.， 2016;Liu et al.， 2016）。进行胚培养的主要目的之一是打破种子休眠加速萌发，缩短育种周期（王雪玲，2014）。胚培养受很多条件的影响，如胚的品种、胚龄、培养基种类、激素种类和浓度、碳水化合物种类和浓度、光照、温度、pH值等（田玲，2007; 雷秀娟，2013）。胚培养技术已经在浙贝母（苏新，1995）、人参（雷秀娟，2013）、伊贝母（李丽，2017）、橄榄（Germana et al.， 2014）等药用植物研究中取得成功。目前未见有关华重楼种子离体胚培养的报道。

重楼属（Paris）植物结籽量大，种子数量多，是繁殖的好材料。但由于其植物本身特殊的生物学特性，种子在自然条件下，需要两冬一夏才能萌发并且萌发率低、植株生长缓慢（李运昌，1982），常规育种难以保证市场的需要。能否利用重楼种子数量多的特点和组织培养具有高繁殖效率的优点，直接诱导重楼离体幼胚发育形成植株？本试验通过离体胚培养技术来克服重楼种子难以萌发的缺点，缩短育种周期。用胚培养技术研究光照和植物生长调节剂对华重楼种子离体幼胚萌发及成苗的影响，旨在使发育不完全的胚快速发育，缩短萌发时间和出苗时间，同时也为重楼属植物的繁殖研究探索出一条新途径。

1 材料与方法

1.1 材料

华重楼种子采自峨眉山生物资源实验站，挑选新鲜健康、大小均匀一致的华重楼种子备用。

1.2 方法

1.2.1 华重楼种子预处理 将去除外种皮的华重楼种子用流水冲洗30 min，用滤纸将种子表面的水分吸干，在超净工作台中用0.1%的HgCl2消毒10 min、无菌水冲洗5次、每次1 min。消毒后接种在MS培养基中，放入人工气候箱培养6个月。人工气候箱条件设置：温度20 ℃，光照1 500 lx，11 h·d-1，湿度65%;温度4 ℃，光照0 lx，湿度75%，13 h·d-1。

1.2.2 华重楼种胚剥离 将双目体视镜下置于超净工作台中，用手术刀和解剖针在双目体视镜下将处理6个月后的华重楼种胚取出并接种于装有“华重楼离体幼胚生长发育培养基”的培养皿中。

1.2.3 植物生长调节剂对华重楼离体幼胚生长发育的影响 离体幼胚生长发育培养基：1/2 MS+30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1琼脂+0.5 g·L-1 活性炭+ IAA+GA3，pH为5.8～6。采用2因素3水平L9（23）实验设计研究IAA、GA3对华重楼离体幼胚生长发育的影响，并以不添加IAA、GA3的“离体幼胚生长发育培养基”为对照组（表1）。每个培养皿接种4颗华重楼离体幼胚，用封口胶密封培养皿后倒置于人工气候箱中培养，每个组重复6次。

1.2.4 光照对华重楼离体幼胚生长发育的影响 为研究不同光照对华重楼离体幼胚生长发育的影响， 将1.2.3中接种的每组培养皿平均分为两部分，分别置于光培养和暗培养条件下进行培养。光培养条件：光照1 500 lx，温度20 ℃，湿度 65%，11 h·d-1;光照0 lx，温度15 ℃，湿度75%，13 h·d-1。暗培养条件：光照0 lx，温度20 ℃，湿度65%，11 h·d-1;光照0 lx，温度15 ℃，湿度75%，13 h·d-1。此后，每隔2 d分别取样在双目体视镜下观察华重楼离体幼胚的形态变化。

1.2.5 植物生长调节剂对华重楼成熟胚出苗的影响 子叶长出0.1～0.2 cm视为离体胚发育成熟。将健康、长势一致的成熟胚转接到出苗培养基中诱导成熟胚出苗。出苗培养基：MS+30 g·L-1蔗糖+6.2 mg·L-1硼酸+7 g·L-1琼脂+0.7 g·L-1活性炭+2，4-D+IAA+ZT+GA3，培养基pH为5.8～6，每组重复3次。采用4因素3水平L9（34）实验设计研究2，4-D、IAA、ZT、GA3對华重楼成熟胚出苗的影响，并以不添加2，4-D、IAA、ZT、GA3的“出苗培养基”为对照组（表2）。培养条件：光照1 500 lx，温度22 ℃，湿度60%，11 h·d-1;光照0 lx，温度15 ℃，湿度75%，13 h·d-1。

2 结果与分析

2.1 光照对华重楼离体幼胚发育的影响

由表3可知，光照条件下，培养到60 d时离体幼胚生长率仅为22.25%，萌发率仅为7.5%，绝大多数离体幼胚在生长过程中褐化死亡。暗培养条件下，培养到60 d时离体幼胚生长率为67.5%，萌发率为26.67%。由此可见暗培养更有利于华重楼离体幼胚生长发育。

2.2 植物生长调节剂对华重楼离体幼胚萌发的影响

由图1可知，对照组处理下华重楼离体幼胚需要194 d才能萌发，不同浓度的GA3+IAA组合处理都能显著促进华重楼离体胚萌发。当GA3浓度相同时，离体幼胚萌发所需时间随IAA浓度增加而延长。说明低浓度IAA促进作用强于高浓度IAA。当IAA浓度相同时，不同浓度的GA3都可促进离体幼胚萌发， 促进作用由强到弱依次为对不同处理组下华重楼离体幼胚萌发率达50%所需时间进行统计。除A9组外，其他处理组都能显著促进华重楼离体幼胚萌发，A4组萌发率达50%所需时间最短，仅需79.67 d，比对照组提前168.66 d（图2）。

综上所述，A4组配方（1/2 MS+30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1琼脂+0.5 g·L-1活性炭+5 mg·L-1 GA3 +1 mg·L-1 IAA）最有利于华重楼离体幼胚萌发。

2.3 A4组中华重楼离体幼胚形态变化

接种时华重楼离体胚为球形胚（图版Ⅰ： A， 图版Ⅱ：A）。在A4中培养24 d离体幼胚分化出胚柄（图版Ⅰ：B）。对照组需培养75 d才能分化出胚柄（图版Ⅱ：B），且其胚柄比A4组的胚柄短。在A4组中培养35 d离体幼胚分化出胚根，平均长3 mm（图版Ⅰ：C），而对照组培养130 d才初步分化出胚根，平均长0.5 mm（图版Ⅱ：C）。A4组中培养54 d离体幼胚分化出子叶（图版Ⅰ：D），对照组培养154 d离体幼胚才可初步分化出子叶（图版Ⅱ：D）。在A4组中继续培养11 d离体幼胚继续长大，胚根、胚轴、子叶分化更明显，芽原基初步形成，离体幼胚发育成熟（图版Ⅰ：E）。此时子叶平均长2 mm，胚根平均长5 mm。离体幼胚在对照组中需继续培养24 d左右才可形成芽原基（图版Ⅱ：E）。

2.4 植物生长调节剂对华重楼成熟胚出苗的影响

由表4可知，B3、B4、B8处理下成熟胚都不能正常出苗，可能是由于这三组培养基中赤霉素浓度过高（GA3为10 mg·L-1）。除这三组外，其他处理组都可诱导成熟胚出苗。B2组平均出苗时间最短，仅需43 d，比对照组快38 d。在对照组中不能形成真叶。虽然B2组与B9组诱真叶形成所需时间最短且无显著差异，但是B2组中华重楼幼苗茎叶生长速度比B9组快。

综上所述，B2组配方（MS+30 g·L-1蔗糖+6.2 mg·L-1硼酸+7 g·L-1琼脂+0.7 g·L-1活性炭+0.5 mg·L-1 2，4-D +1.5 mg·L-1 IAA +1.5 mg·L-1 ZT+ 5 mg·L-1 GA3）最有利于华重楼成熟胚出苗。

2.5 B2组中华重楼成熟胚出苗过程

在B2组培养条件下10 d左右子叶可转绿且胚根明显变长（图版Ⅲ：A），43 d左右子叶展开形成幼苗（图版Ⅲ：B）， 75 d左右形成真叶（图版Ⅲ：C），培养到150 d时幼苗生长状况良好（图版Ⅲ：D）。在对照组培养条件下10 d左右子叶也可转绿（图版Ⅳ：A），但胚根生长缓慢，81 d左右才出苗（图版Ⅳ：B），培养到150 d时也未见真叶形成，只见幼苗长大（图版Ⅳ：C）。

3 讨论与结论

光照是植物生长发育过程中的重要环境因子，在种子休眠过程中光通过光敏素系统对种子萌发起调控作用。虽然光照与离体胚生长发育间的关系还有待进一步探究，但已有很多研究表明光照会导致愈伤组织褐化。李树丽（2014）发现光照强度越强，中华红叶杨外植体褐化率越高，而暗培养10 d可将其褐化率降低到18%。杨爽等（2012）也发现野生手掌参离体芽暗培养5～10 d比直接光照培养好，褐化较轻，腋芽萌动时间早、长势好。汤浩茹等（2000）在黑暗培养条件下成功取得了德国核桃No.120的幼胚、胚轴、子叶。本研究也表明黑暗培养条件更有利于华重楼离体胚生长发育。其原因可能是在离体胚培养条件下，黑暗条件模拟了华重楼种胚在种子中的生长环境。另外，采取完全黑暗培养可避免酚类物质的毒害（赖钟雄等，1997）。但红豆杉（Yang et al.，2010）和伊贝母（李丽，2017）的离体胚更适合在适宜光照条件下发育。

植物生长调节剂在植物组织培养中起关键作用，对培养基中植物生长调节剂种类和浓度进行调整，可有效地影响植物体内源激素水平，影响培养物本身基因表达，进而影响器官形成和组织分化过程，影响培养物形态重建（李丽等，2018;穆瑢雪等，2018）。生长素会影响胚发生、根发育，叶展开等植物生长发育过程（Woodward & Bartel，2005;Zhao，2010）。GA3能显著提高西洋参杂种幼胚的萌发率（雷秀娟，2013），低浓度的IAA有利于伊贝母离体胚生长发育，而高浓度的IAA则不利于其离体胚的生长发育（李丽，2017）。本研究结果与此类似。植物生长调节剂不同组合方式不仅影响出苗率还影响出苗方式和幼苗生长状态（李程，2013;Tang，2014;Raomai et al.，2014）。本研究中，离体胚成熟胚在B2配方中出苗所用时间最短，幼苗生长状态最好。高浓度的GA3会导致成熟离体胚褐化死亡，在不添加植物生长调节剂的情况下不能诱导形成真叶。离体幼胚A4配方中能快速萌发，成熟胚在B2配方中能快速出苗可能是因为植物生长调节（GA3、IAA）调控了赤霉素和生长素信号转导通路和生物合成途径中相关基因的表达。本实验室对GA3和IAA组合调控华重楼种子萌发机理进行了探究。经高通量转录组测序和pathway通路分析发现，外源施加GA3和IAA可使GA分解代谢基因GA2ox下调表达，GA合成基因GA20ox上调表达，GA信号通路中GID1下调表達，PIF4上调表达。外源施加IAA可使IAA合成通路中YUCCA、ALDH上调表达，生长素的受体蛋白AUX1、AUX/IAA、SAUR等上调表达。因此，在华重楼离体胚培养的培养基中添加GA3与IAA或许也可促进GA、IAA合成代谢和信号转导，从而加速离体幼胚成熟与出苗。

综上所述，黑暗条件有利华重楼离体胚的生长发育。在本研究条件下，适宜浓度的GA3与IAA组合可使华重楼离体胚快速生长发育，提前萌发。适宜浓度的2，4-D+IAA+ZT+GA3组合可缩短成熟华重楼成熟胚出苗时间，且诱导形成真叶。高浓度的GA3会导致成熟胚死亡。离体胚培养可明显缩短华重楼种胚萌发、出苗时间。

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（责任编辑 何永艳）