两段式发酵法中晒露阶段酱醪理化情况的研究

董亮,张晶,叶碧霞,左勇*

(1.四川轻化工大学 生物工程学院，四川 自贡 643000;2.重庆大学 生物工程学院，重庆 400030)

甜面酱是以面粉作为原料，经蒸煮糊化后，人工接种曲种(常用沪酿3.042)制曲[1]，再拌入适量盐水进行发酵而成的半固态调味品。甜面酱的生产方式主要是基于拌盐水后发酵方式的不同进行划分，常用的发酵方式有自然晒露发酵方式和人工保温发酵[2,3]。根据目前生产实际的情况，现有的两种生产方式各有优缺点，前者传统自然晒露发酵生产的甜面酱色泽鲜亮、香气浓郁、滋味鲜甜咸适宜，但因其发酵过程中始终依靠外界环境的温度促使发酵，整个发酵过程缓慢进行，原料降解缓慢，从而使得发酵周期较长，通常需1年以上成熟，影响企业的产能提升。而保温发酵通过控制发酵温度，使得原料快速降解，发酵周期短，但该方式生产的甜面酱成品色泽较淡，酯香与酱香不够协调，同时酱体较稀，成品质量不足以媲美传统自然晒露发酵所生产的甜面酱[4]。基于现有的两种生产方式所提出的两段式发酵法即先保温发酵后自然晒露发酵的生产方式在面酱的生产应用上具有一定前景[5,6]。甜面酱制曲优势微生物主要为霉菌，其在制曲阶段大量繁殖并分泌各种酶类，如淀粉酶、蛋白酶等，多种酶类共同作用分解原料中的淀粉和蛋白质，形成的小分子糖类、多肽及氨基酸进一步参与各种化学反应促使甜面酱成色、生香以及构成甜面酱的独特滋味[7-10]。

目前，对于两段式发酵技术的深入研究鲜有报道。基于前期对两段式发酵法的初步研究结果表明，保温阶段主要为大分子糖类及蛋白质的快速降解。保温20～40 d后则可结束保温发酵，进入下一阶段即自然晒露阶段发酵。本研究以前期保温发酵后再进行自然晒露发酵的甜面酱作为研究对象，研究甜面酱后期自然晒露过程中理化指标的变化情况，并结合晒露过程中酱体感官形态的变化情况，以确定甜面酱两段式发酵成熟的生产周期，以期为甜面酱后期晒露发酵工艺的改善提供参考。

1 材料与仪器

1.1 材料

取分别保温发酵20，25，30，35，40 d后的甜面酱进行晒露阶段的研究，样品分别编号为1，2，3，4，5。以各自晒露开始时间计为0，取样时间设置为0，5，8，14，22，34，49，68 d。

工艺流程：面粉、水→拌和→蒸煮→冷却→接种(曲精)→制曲→拌盐水→保温发酵(一定时间)→一次磨酱→晒露发酵→二次磨酱→检验→包装。

1.2 仪器

T6新世纪紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；pHS-3C酸度计 奥豪斯仪器(上海)有限公司；HH-S恒温水浴锅 江苏省金坛市正基仪器有限公司；台式高速微量离心机 大龙创新试验仪器(北京)有限公司。

2 试验方法

2.1 理化值的测定

总酸及氨基酸态氮的测定：采用直接滴定和甲醛滴定法；还原糖含量的测定：采用斐林法[11]。

2.2 酶活力的测定

淀粉酶活力的测定：采用碘量法[12]；中性和酸性蛋白酶活力的测定：依据国标法测定[13]。

2.3 感官形态记录

依据标准SB/T 10296-2009要求，感官形态记录涵盖甜面酱的色泽、香气、滋味与体态。

2.4 数据分析与处理

试验数据均采用SPSS 19.0软件进行分析，采用Duncans新复极差法进行多重比较[14]。在0.05水平上检验试验结果的差异显著性，试验结果利用Origin作图。

3 结果与分析

3.1 甜面酱晒露阶段总酸及pH的变化情况

甜面酱中酸度主要源自微生物发酵产生的有机酸、氨基酸等[15]。有机酸是酯类物质生成的基础底物，适量的有机酸生成对面酱的呈香具有重要作用，但过量的有机酸会严重影响甜面酱的风味的品质[16]。评价甜面酱的质量通常依据标准SB/T 10296-2009所规定的指标进行，其中甜面酱的感官特性中关于滋味的描述中，明确要求无酸味。故甜面酱发酵过程中，需要严格控制酱醪酸度，因而通过测定酱醪酸度变化情况反映发酵状况。经保温发酵一定时间的甜面酱，采用陶质瓦缸(缸口加一不锈钢筛盖)盛装，置于室外开放环境下，进行日晒夜露发酵，定期进行翻醅处理。

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注：误差线代表标准偏差(n=3)；不同小写字母表示总酸含量差异显著(P<0.05)；不同大写字母表示pH值差异显著(P<0.05)；a～e分别代表1～5号样品在晒露阶段的总酸与pH变化情况。

由图1中a可知，经保温发酵20 d再进行晒露发酵的甜面酱，在晒露阶段，酱醪中总酸含量先上升后趋于平稳，pH值随着发酵的进行逐渐降低。0～22 d，甜面酱总酸含量逐渐上升(P<0.05)，从1.5%上升到1.85%，22 d后总酸含量上升趋势减缓，晒露发酵68天时，酱醪中总酸含量达到1.97%。pH值则由晒露初期的4.75下降到晒露后期的3.7。

由图1中b可知，经保温发酵25 d再进行晒露发酵的甜面酱，在晒露阶段，酱醪中总酸含量逐渐增加，pH值则逐渐降低。酱醪总酸含量从1.46%增加到1.68%；pH值从4.78下降为4.02。

由图1中c可知，经保温发酵30 d再进行晒露发酵的甜面酱，在晒露阶段，酱醪中总酸含量逐渐上升，pH值随之降低。酱醪总酸含量由1.48%上升至2.13%，该阶段总酸含量增加了0.65%。pH值从4.33降低到3.65。

由图1中d可知，经保温发酵35 d再进行晒露发酵的甜面酱，在晒露阶段，酱醪中总酸含量随着晒露时间的延长而增加，pH值则逐渐下降。总酸含量由1.61%上升到2.05%。酱醪pH值由4.12下降到3.7，降低趋势较缓慢。

由图1中e可知，经保温发酵40 d再进行晒露发酵的甜面酱，在晒露阶段，酱醪中总酸含量呈上升趋势，pH值则相应下降。总酸含量从1.69%迅速上升为2.25%(P<0.05)，该阶段总酸含量增加了0.56%；酱醪的pH值则由4降低为3.6。

图1结果表明，两段式发酵甜面酱晒露阶段，酱醪中总酸含量逐渐增加，pH值相应降低。分析造成酸度逐渐上升的原因有：晒露阶段，环境中微生物进入酱醪，微生物发酵产酸以及原料中蛋白质水解生成的氨基酸会造成酱醪中总酸含量逐渐上升。晒露发酵68 d后的甜面酱中总酸含量最低的是2号样品，约为1.68%，pH值为4.02；总酸含量最高是5号样品，约为2.25%，pH值为3.6，1，3，4号样品中总酸含量分别为1.97%、2.13%、2.05%，pH值分别为3.88，3.65，3.7。

3.2 甜面酱晒露阶段还原糖与淀粉酶活力的变化情况

还原糖主要源自原料水解。在甜面酱发酵过程中，一部分还原糖作为乳酸、酒精发酵等底物生成有机酸类物质和高级醇等，一部分还原糖作为微生物生长的碳源，还有一部分参与色素的形成[17]。淀粉酶能够催化原料中淀粉质降解为小分子还原糖，因而其在甜面酱发酵过程中起着重要作用。

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注：误差线代表标准偏差(n=3)；不同小写字母表示还原糖含量差异显著(P<0.05)；不同大写字母表示淀粉酶活力差异显著(P<0.05)；a～e分别为1～5号样品晒露阶段的还原糖与淀粉酶活力变化情况。

由图2中a可知，经保温发酵20 d再进行晒露发酵的甜面酱，晒露过程中，酱醪中还原糖含量先缓慢上升后略微下降直至稳定，淀粉酶活力则逐渐降低。0～14 d，还原糖含量逐渐上升(P<0.05)，酱醪中还原糖含量从25.92%上升到29.58%；14～34 d，酱醪中还原糖含量略微下降到27.81%，此后还原糖含量整体变化不显著(P>0.05)，其含量维持在27.8%左右。淀粉酶活力从50.78 U/g下降到6.58 U/g，整个晒露阶段淀粉酶活力降低了44.2 U/g。晒露前期，还原糖含量有所增加，其原因在于此阶段淀粉酶活力仍发挥作用，继续催化原料中的淀粉质物质进一步降解为小分子还原糖类。晒露发酵14 d，测得酱醪中还原糖含量达到峰值，之后还原糖含量开始下降，原因有：其一，还原糖部分作为微生物代谢碳源；其二，还原糖参与焦糖色素生成；其三，还原糖通过酒精、乳酸等发酵生成有机酸、高级醇等物质。晒露后期，酱醪中还原糖含量维持稳定的主要原因在于：酱醪酸度增大，微生物活动降低，还原糖消耗降低，基本维持稳定。

由图2中b可知，经保温发酵25 d再进行晒露发酵的甜面酱，在晒露阶段，酱醪中还原糖含量先上升后降低至基本稳定，淀粉酶活力则逐渐降低。0～14 d，甜面酱中还原糖含量逐渐上升(P<0.05)，其含量从26.12%上升到29.58%，此阶段还原糖含量增加了3.46%。14～22 d，此阶段还原糖含量有所降低，从29.58%减小至28.68%；此后，随着晒露时间的延长，酱醪中还原糖含量整体变化不显著(P>0.05)，晒露发酵68 d后，酱醪中还原糖含量约为28.57%。0～14 d，淀粉酶活力从43.46 U/g迅速下降到11.27 U/g；14～68 d，该阶段淀粉酶活力缓慢降低;68 d时，淀粉酶活力约为5.85 U/g。

由图2中c可知，经保温发酵30 d再进行晒露发酵的甜面酱，在后期晒露过程中，酱醪中还原糖含量先上升后缓慢降低，淀粉酶活力逐渐降底。0～8 d，还原糖含量逐渐上升(P<0.05)，酱醪中还原糖含量约由26.55%上升至28.19%，此阶段还原糖含量增加了1.64%。此后，随着晒露时间的延长，酱醪中还原糖含量逐渐降低，从28.19%下降为27.14%。甜面酱中淀粉酶活力从34.61 U/g降低至3.85 U/g。

由图2中d可知，经保温发酵35 d再进行晒露发酵的甜面酱，在晒露过程中，酱醪中还原糖含量先缓慢上升后逐渐降低，淀粉酶活力逐渐下降。0～5 d，甜面酱中还原糖含量逐渐上升(P<0.05)，其还原糖含量从27.32%增加为28.15%。此后，随着晒露时间的延长，酱醪中还原糖含量逐渐降低，由28.15%下降为27.46%。0～68 d，淀粉酶活力从27.56 U/g减小到5.34 U/g。

由图2中e可知，经保温发酵40 d再进行晒露发酵的甜面酱，在晒露过程中，酱醪中还原糖含量略有降低，淀粉酶活力则逐渐降低。还原糖含量从27.25%减少为26.21%；淀粉酶活力从15.51 U/g逐渐下降至2.56 U/g。

图2结果表明，甜面酱晒露阶段还原糖含量均先逐渐上升后有所降低，而淀粉酶活力则逐渐下降至稳定。总体来看，原料中淀粉质物质降解为还原糖使得其含量逐渐上升，同时晒露阶段微生物的发酵作用会利用部分还原糖，故还原糖含量变化较小，这是后期还原糖含量维持稳定的原因。晒露阶段淀粉酶活力降低，其原因有：随着晒露进行，酱醪中水分含量降低，微生物数量减少，酱醪酸度加大，使得淀粉酶活力受到抑制，同时高盐的环境进一步抑制酶活力。甜面酱先经保温发酵不同时间后，再进行晒露发酵68 d，其中还原糖含量最高的是2号样品，约为28.57%；还原糖含量最低是样品5，其含量约为26.21%，1，3，4号样品中还原糖含量分别约为27.81%、27.14%、27.46%。

3.3 甜面酱晒露阶段氨基酸态氮与蛋白酶活力的变化情况

氨基酸态氮的含量一定程度上反映蛋白质的水解程度，甜面酱中氨基酸主要源自蛋白酶水解蛋白生成，其作为重要的风味成分，部分氨基酸提供呈味作用，同时氨基酸还会通过美拉德反应参与面酱的成色[18,19]。

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注：误差线代表标准偏差(n=3)；不同小写字母表示氨基酸态氮含量差异显著(P<0.05)；不同大写字母表示酸性蛋白酶活力差异显著(P<0.05)；不同希腊字母表示中性蛋白酶活力差异显著(P<0.05)；a～e分别为1～5号样品在晒露阶段的氨基酸态氮与蛋白酶活力变化情况。

由图3中a可知，经保温发酵20 d再进行晒露发酵的甜面酱，在后期晒露过程中，酱醪中氨基酸态氮含量先上升后略微下降至基本稳定，而蛋白酶活力则在整个晒露阶段均呈现下降趋势。0～8 d，此阶段酱醪中氨基酸态氮含量逐渐上升，8 d时氨基酸态氮含量达到最大约为0.44%。8～68 d，氨基酸态氮含量从0.44%逐渐降低为0.41%。晒露阶段，中性蛋白酶活力从63.49 U/g降低到6.42 U/g，酸性蛋白酶活力则由101.15 U/g减少为31.56 U/g。

由图3中b可知，经保温发酵25 d再进行晒露发酵的甜面酱，在后期晒露过程中，酱醪中氨基酸态氮含量逐渐上升至基本稳定，蛋白酶活力则逐渐降低。0～8 d，该阶段甜面酱中氨基酸态氮含量由0.39%上升至0.43%；8～68 d，氨基酸态氮含量从0.43%缓慢降低至0.41%。通过显著性差异分析可知，5～68 d，该晒露阶段中氨基酸态氮含量无显著性差异(P>0.05)，表明在晒露过程中氨基酸态氮含量无显著性变化。0～68 d，中性蛋白酶活力从38.21 U/g降低到9.65 U/g，酸性蛋白酶活力则由92.32 U/g减少为42.33 U/g。

由图3中c可知，经保温发酵30 d再进行晒露发酵的甜面酱，在后期晒露过程中，酱醪中氨基酸态氮含量先上升后缓慢降低，蛋白酶活力则迅速下降。0～8 d，该阶段甜面酱中氨基酸态氮含量从0.39%上升为0.42%；8～68 d，氨基酸态氮含量由0.42%逐渐下降至0.4%。晒露阶段，中性蛋白酶活力从27.22 U/g降低到3.24 U/g，酸性蛋白酶活力则由80.74 U/g减少为14.76 U/g。

由图3中d可知，经保温发酵35 d再进行晒露发酵的甜面酱，在后期晒露过程中，酱醪中氨基酸态氮含量先上升后趋于稳定，蛋白酶活力逐渐降低。0～14 d，酱醪中氨基酸态氮含量从0.39%增加为0.42%；晒露发酵14 d之后，酱醪中氨基酸态氮含量无显著性差异(P>0.05);68 d，氨基态氮含量约为0.41%。晒露阶段，中性蛋白酶活力由12.24 U/g降低到5.08 U/g，酸性蛋白酶活力则从78.04 U/g下降至18.99 U/g。

由图3中e可知，经保温发酵40 d再进行晒露发酵的甜面酱，在晒露过程中，酱醪中氨基酸态氮含量略微有增加后趋于稳定，晒露发酵68 d，氨基酸态氮含量约为0.42%。随着晒露时间的延长，酱醪中蛋白酶活力则逐渐降低，其中，中性蛋白酶活力从7.66 U/g降低到2.34 U/g，酸性蛋白酶由62.71 U/g下降至12.23 U/g。

图3结果表明，甜面酱晒露阶段氨基酸态氮含量逐渐上升，后期有所下降，而蛋白酶活力在整个晒露过程中均逐渐减小。晒露初期，中性蛋白酶及酸性蛋白酶共同作用促使原料中未降解完全的蛋白质继续水解为氨基酸，使得氨基酸态氮含量逐渐上升；晒露阶段后期，氨基酸经脱氨、脱羧反应参与其他物质生成使得含量有所下降，同时，蛋白酶活力虽降低但仍发挥催化作用，又促使氨基态氮含量上升，两者共同作用维持晒露后期酱醪中氨基酸态氮含量略微下降至基本稳定。晒露阶段蛋白酶活力进一步降低，其原因有：其一，经过前期的保温发酵，酱醪中pH值进一步下降；其二，随着发酵过程中水分含量降低，食盐相对浓度增加，从而抑制酶活力。因酸性蛋白酶较中性蛋白酶所受影响小，整体而言，酸性蛋白酶活力要高于中性蛋白酶活力。甜面酱经保温发酵不同时间后，再进行晒露发酵68 d，其中氨基酸态氮含量最高的为5号样品，其含量约为0.42%；3号样品的氨基酸态氮含量最低，约为0.4%；其余样品中氨基酸态氮含量约为0.41%。整体而言，样品间氨基酸态氮含量无显著性差异(P>0.05)。

3.4 甜面酱晒露阶段酱体感官变化情况

对保温不同时间的甜面酱分别经晒露成熟的样品进行感官评定，结果见表1。

表1 甜面酱晒露阶段酱体的感官记录Table 1 Sensory record of sweet soy bean paste during insotation and exposure stage

续 表

由表1可知，甜面酱在晒露发酵过程中，感官形态随着发酵的进行发生动态变化，晒露阶段，酱醪色泽逐渐趋于成熟要求，滋味香气互相协调，此阶段主要为生香、成色的过程。结合3.1～3.3理化指标的测定结果和标准SB/T 10296-2009要求，分别保温发酵20，25，30，35，40 d的甜面酱在经晒露相同时间70 d左右后基本成熟，两段式保温发酵生产甜面酱的周期在3～4个月左右，比人工保温发酵周期长1～2个月，但缩短自然晒露发酵周期8～9个月。

4 结论

保温发酵不同时间的甜面酱，在晒露发酵相同时间70 d左右，酱醪理化指标与感官形态基本符合标准SB/T 10296-2009中对甜面酱达到成熟的要求。两段式发酵生产甜面酱的周期在3～4个月左右，比自然晒露发酵的生产周期缩短8～9个月。

结合理化指标与感官形态确定了甜面酱两段式发酵的生产周期，后期研究将通过对比保温发酵不同时间后经晒露成熟的甜面酱成品质量来进一步确定最佳的保温发酵时间。