牛诺如病毒及牛嵴病毒双重PCR 检测方法的建立及初步应用

师志海，徐照学，兰亚莉，王文佳

（1.河南省农业科学院畜牧兽医研究所，郑州 450002；2.河南牧业经济学院 制药工程学院，郑州 450046；3.河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室，郑州 450002）

牛诺如病毒（Bovine norovirus，BNoV）是杯状病毒科、诺如病毒属的单股正链RNA病毒，能够引起犊牛腹泻，各年龄段犊牛均易感。该病毒首次在英国腹泻犊牛的粪便中被发现[1]，随后欧洲、美洲及亚洲各地也相继检测出该病毒[2-4]。我国于2017年首次检测出该病毒[5]，且目前在我国只检测出基因型1的BNoV。BNoV在我国的流行病学调查及分子遗传演化目前尚无报道。牛感染BNoV后会出现腹泻、厌食、吸收不良、精神不振的临床症状，腹泻常持续3～4 d，3周龄的犊牛比新生犊牛发病严重。目前还没有合适的细胞类型用于培养BNoV，健康牛的肠道也可携带BNoV，因此，BNoV对犊牛腹泻的致病机制也尚不清楚[6]。

牛嵴病毒（Bovine kobuvirus，BKoV），又名Aichivirus B，是无囊膜的RNA病毒，小RNA病毒家族的成员之一。目前国际上公认的嵴病毒有人爱知病毒（Aichi virus，AiV）和牛嵴病毒，猪嵴病毒（Porcine kobuvirus，PKoV）属于候选病毒[7]。BKoV于2003年首次在健康牛的血清和粪便中被发 现[8]，2008年在腹泻牛的粪便样品中检测到BKoV[9]。由于健康牛和腹泻牛的粪便中都可检测出BKoV[7,10]，所以BKoV是否能够直接引起新生犊牛腹泻，尚不清楚。

1 材料与方法

1.1 病料牛诺如病毒（B N o V）、牛嵴病毒（BKoV）、牛冠状病毒（Bovine coronavirus，BCoV）、牛星状病毒（Bovine astrovirus，BAstV）、牛轮状病毒（Bovine rotavirus，BRV）、牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）、牛纽布病毒（Bovine nebovirus，BNeV）阳性病料均由本实验室收集、鉴定和保存。127份粪便样本采集于河南地区的牛场4月龄以下腹泻犊牛的粪便。

1.2 主要试剂MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit、PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、PremixTaq、DNA Marker 2000、pMD 18-T、大肠杆菌DH5α感受态均购自TaKaRa公司；Gel Extraction Kit、Plasmid Mini Kit购自OMEGA公司。

1.3 临床样品处理及病毒核酸提取127份临床样品，用PBS 按1∶10（w∶v）混悬，漩涡震荡30 s，4℃条件下8000 r/min离心5 min，收集上清，-80℃保存备用。采用Viral RNA/DNA Extraction Kit提取总RNA，利用反转录试剂盒制备cDNA，-20℃保存备用。

1.4 引物的设计及合成根据GenBank上发表的BNoV病毒基因的保守序列，利用Prime Premier 5.0软件对病毒基因的保守区域设计1对引物，预计扩增片段为542 bp；BKoV的引物参考参考文献[11]，预计扩增片段为216 bp。引物由华大基因生物科技有限公司合成，引物序列信息见表1。

表1 本研究引物Table 1 The information of primers used in this study

1.5 双重PCR扩增双重PCR的最佳反应体系PremixTaq10 μL，上、下游引物各0.25 μL（10 pmol/μL），BNoV和BKoV的混合cDNA模板1 μL，ddH2O补足20 μL；扩增程序：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸2 min，30个循环；72℃再延伸7 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。单一PCR的反应体系：PremixTaq10 μL，上、下游引物各0.5 μL，单一cDNA模板1 μL，ddH2O补足20 μL；扩增程序同双重PCR反应。

1.6 特异性试验采用本研究建立的双重PCR方法对BKoV、BNoV、BCoV、BRV、BAstV、BVDV、BNeV进行检测，同时设置阴性对照，验证建立的PCR方法的特异性。

1.7 敏感性试验用上述引物分别对BKoV和BNoV的阳性样品进行单一PCR扩增，回收产物，分别与pMD18-T载体连接，构建阳性模板质粒，并测序验证扩增序列的准确性。用超微量核酸蛋白分析仪测定质粒浓度，计算模板质粒拷贝数，10倍稀释后进行双重PCR测定，同时设定阴性对照。

1.8 重复性试验以构建的阳性质粒为模板，用本研究建立的双重PCR方法每隔一周重复检测1次，连续检测3次，确定检测结果的可靠性和重复性。

1.9 应用性试验利用本研究所建立的BNoV和BKoV单一及双重PCR检测方法对河南不同地区的127份粪便样本进行检测，比较检测结果的一致性，并将扩增产物进行测序分析，评估该方法的实用性。

2 结果

2.1 双重PCR扩增结果分别以BNoV和BKoV单一cDNA和混合cDNA为模板，用建立的双重PCR同时扩增，以ddH2O做阴性对照。结果显示，单一PCR分别扩增出约216 bp和542 bp的单一特异性条带，双重PCR可扩增出216 bp和542 bp特异性条带，均与预期目的条带大小一致（图1）。

图1 BNoV、BKoV 的双重和单一PCR 扩增产物Fig.1 The duplex and single PCR products of BNoV, BKoV

2.2 特异性试验分别以BNoV和 BKoV的单一cDNA和混合cDNA为模板，BCoV、BAstV、BRV、BVDV、BNeV的cDNA为模板，用建立的方法进行双重PCR扩增。结果显示，仅BKoV和BNoV能扩出特异性条带，且与目的片段大小一致，其他病毒均未扩增出条带（图2）。

图2 双重PCR 的特异性试验Fig.2 Specificity of the duplex PCR for BKoV and BNoV

2.3 敏感性试验以BNoV和 BKoV的混合质粒10倍稀释后作为模板，进行双重PCR扩增。结果显示，BKoV最低检测限为2.23×106copies/μL，BNoV最低检测量为5.39×105copies/μL（图3）。

图3 双重PCR 的敏感性试验Fig.3 Sensitivity test of duplex PCR

2.4 应用性检测用建立的双重和单一PCR检测方法对河南地区127份犊牛腹泻粪便样品进行检测。结果显示，双重PCR方法可以从粪便中特异性地检测出BKoV和 BNoV。将单一和双重PCR的检测结果进行比较（表2），127份粪便样品中，检出BNoV阳性样品8份，阳性率为6.30%；BKoV阳性样品6份，阳性率为4.72%；共感染BKoV和 BNoV的阳性样品2份，阳性率为1.57%；单一和双重PCR的检测结果一致，符合率为100%。

2.5 重复性试验利用建立的双重PCR方法，以BNoV和BKoV的混合质粒为模板，每隔1周重复检测1次，连续检测3次，结果一致。表明该双重PCR方法具有较好的重复性。

表2 临床样品的检测结果Table 2 The detection of clinical samples

3 讨论

被BNoV和BKoV感染的犊牛，临床上均会表现出腹泻症状，剖检时肠道病变较为相似，且两者有时会出现混合感染，故仅靠临床诊断容易造成误诊，妨碍疾病的防控和治疗。传统的病毒诊断方法有电镜观察、病毒分离鉴定、血清学实验、抗原抗体ELISA检测等，耗时耗力，对仪器设备要求高，实验周期长，经济成本高；且BNoV目前尚无合适的细胞培养方法，BKoV也仅在Hela细胞上成功增殖且引起病变[8]。因此，传统的诊断方法无法满足临床上样品数量大、快速灵敏的检测要求。PCR技术因其灵敏、快速、准确的优点，是目前诊断病毒疾病最常用的方法，也是目前诊断BNoV和BKoV感染应用最广泛的方法[6,12]。犊牛腹泻会有几种病毒混合感染的现象出现，仅依靠单一PCR，容易造成漏诊，相较于单一PCR技术，多重PCR技术可在同一次扩增反应中检测多种病原，大大节省检测时间和成本，所以多重PCR技术非常适合于临床样品的检测，对于疾病的确诊及流行病学调查起到重要作用[13]。Sandro等[14]建立了能够同时检测诺如病毒基因群GⅠ、GⅡ、GⅢ的三重PCR检测方法，该方法能够在临床及环境样品中同时检测出人诺如病毒和BNoV，同时该方法也是首次建立的检测BNoV的PCR方法。本研究建立的BNoV和BKoV双重PCR检测方法，未检测出其他能够引起犊牛腹泻的病毒性病原，特异性较好，且对BNoV和BKoV的最低检测限分别为5.39×105copies/μL和2.23×106copies/μL，敏感性较高；应用该方法对河南地区127份粪便样品检测，与单一PCR结果相比，该方法的阳性检出符合率为100%，表明所建立的双重PCR检测方法可用于临床样品的检测。

应用本研究建立的双重PCR检测方法对河南部分地区127份奶牛及肉牛犊牛腹泻粪便样本进行检测，其中BNoV阳性样品8份（6.30%），BKoV阳性样品6份（4.72%），两者共感染的阳性样品2份（1.57%）。目前，世界范围内引起犊牛腹泻的病原主要有细菌、病毒、寄生虫等，单一病原感染或混合病原共感染引起犊牛腹泻的研究已成为科学家的研究热点[15-18]。2017年，BNoV在我国首次被检测 出[5]，其在我国的流行病学调查及与其他病原共感染情况目前国内尚无报道。而BKoV在我国仅在新疆、内蒙古、黑龙江和北京被检测出，本研究首次报道了河南地区犊牛腹泻样品中BNoV和BKoV共感染的情况。

本研究建立的BNoV和BKoV双重PCR检测方法，能从粪便样品中成功检测出BNoV和BKoV，特异性好，可应用于BNoV和BKoV的流行病学调查，也为BNoV和BKoV的早期快速诊断奠定基础。