猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp7α 抗体 ELISA 检测方法的建立

刘 磊，马永彪，肖跃强，沈志强,，张松林

（1.山东省滨州畜牧兽医研究院，滨州 256600；2.山东绿都生物科技有限公司，滨州 256600）

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一种免疫抑制性的急性传染病，是危害全球养猪业的重要疾病之 一[1]。2006年至今，我国爆发了高致病性猪繁殖与呼吸综合征（Highly PRRSV，HP-PRRSV），给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。目前，在我国流行的毒株主要以美洲型为主，欧洲型较少[2-3]。

PRRSV为有囊膜、单股、正链RNA病毒，大小约为15 kb。PRRSV NSPs编码基因包含两大开放阅读框ORF1a和ORF1b，其中ORF1a编码的复制酶多聚蛋白部分PP1a，被蛋白酶水解为10个NSPs蛋白，其中Nsp7有一个保守的内部蛋白酶酶切位点，在蛋白酶的作用下，会被剪切成两个蛋白：Nsp7α和Nsp7β[4]。Nsp7α被证实在病毒RNA的合成中起到了重要作 用[5]，在PRRSV感染中能明确表达，其个别氨基酸位点的变化能显著影响病毒的增殖[6]。将Nsp7α蛋白免疫小鼠后0～202 d，每隔14 d采集一次血样，通过ELISA的方法检测不同时期的抗体水平，结果显示，从28 d开始抗体水平显著增高，到202 d为止，仍能一直维持较高水平，证明该蛋白在病毒的增殖和复制过程中起着决定性的作用[7]。

本研究克隆、可溶性表达了PRRSV DY株的Nsp7α蛋白，利用该蛋白建立了PRRSV Nsp7α血清抗体ELISA检测方法。该方法对临床样品的检测结果与IDEXX ELISA检测试剂盒检测结果的总符合率为93.9%，为PRRSV的抗体检测提供了新的技术支持。

1 材料与方法

1.1 细胞、毒株、菌株及实验动物PRRSV DY株、Marc-145细胞、大肠杆菌感受态细胞DH5α、BL21（DE3）均由本实验室保存；BALB/c小鼠购自济南朋悦实验动物繁育有限公司。

1.2 主要试剂限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自NEB公司；DMEM、胎牛血清、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit、DNA聚合酶、DNA分子量标准、蛋白质分子量标准购自赛默飞世尔科技公司；Plasmid Mini Kit、Gel Extraction Kit、Total RNA Kit Ⅱ购自Omega Bio-Tek公司；5，5-四甲基联苯胺（TMB）购自天根生化科技(北京)有限公司；AMP、IPTG购自索莱宝生物科技有限公司；His标签纯化柱购自GE公司；HRP标记羊抗猪IgG购自EarthOx公司。

1.3 猪血清检测样品的采集和处理PRRSV检测血清样品采自山东各大猪场；标准阴性血清与标准阳性血清均由本实验室自行制备，并经IDEXX公司抗体检测试剂盒检测为阴性与阳性；其他阴、阳性血清，如猪伪狂犬病毒血清、猪瘟病毒血清、猪圆环病毒环血清、猪细小病毒血清均由本实验室保存。

1.4 Nsp7α基因的扩增与原核表达载体的构建参照 PRRSV DY株基因序列（GenBank：JN864948）， 利用Primer Premier 5.0软件设计引物，pNsp7α-s： 5"-GGGGGATCCTCTCTGACTGGTGCCCT-3"； pNsp7α-r：5"-GGGAGCTCCTCCAGAACTTT CGGTG-3"，引物由生工生物（上海）股份有限公司合成。下划线部分为限制性内切酶BamHⅠ和SacⅠ的酶切位点序列。按照RNA提取试剂盒说明书提取PRRSV DY株的RNA，并按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书其反转录为cDNA。以PRRSV DY株cDNA为模板，pNsp7α-s、pNsp7α-r为引物，PCR扩增Nsp7α片段，回收扩增产物，-20℃保存备用。将质粒pET-32a(+)以及Nsp7α扩增片段用BamH Ⅰ、SacⅠ双酶切，连接构建重组质粒。双酶切鉴定后，送上海生物工程有限公司测序，将正确的重组质粒命名为pET-Nsp7α。

1.5 重组蛋白的表达纯化与鉴定将重组质粒pETNsp7α转化至大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3），挑取单克隆接种于10 mL LB/Amp培养基中，37℃过夜培养。按照1∶10体积比接种至LB/Amp培养基中扩大培养，OD600值达到0.6左右时加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，30℃条件下诱导表达5 h。 12 000 r/min 离心10 min，收集并超声波裂解菌体，分离上清和沉淀，SDS-PAGE分析鉴定重组蛋白表达情况。采用His标签Ni-NTA亲和层析方法纯化目的蛋白，具体操作过程按说明书进行。纯化蛋白经SDS-PAGE鉴定后，转移至硝酸纤维素膜上，用PRRSV阳性猪血清进行Western blot分析。

1.6 抗原最佳包被浓度和血清稀释度的确定将纯化后的Nsp7α蛋白用包被液梯度稀释为2 μg/mL、1.5 μg/mL、1.0 μg/mL、0.75 μg/mL，每孔加入100 uL封闭过夜；PRRSV猪阳性血清和阴性血清梯度稀释为5个稀释度1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160，每孔加入100 μL，37℃ 孵育30 min进行ELISA方阵试验。计算阳性血清孔与阴性血清孔的平均OD450P/N比值，比值最大的孔所对应的抗原包被浓度和阴阳性对照的稀释度为最佳条件，以此确定最终蛋白包被浓度和血清稀释度。

1.7 封闭液的筛选分别用5%BSA、10%牛血清、5%牛血清、8%羊血清、10%脱脂奶粉5种封闭液，4℃封闭过夜，分别用阴、阳性血清检测其OD450值，以P/N值最大的为最佳封闭液。

1.8 酶标二抗稀释倍数与TMB底物作用时间的确定按已确定条件进行ELISA，酶标二抗的稀释度分别为1∶2000、1∶4000、1∶6000、1∶8000、1∶10000；底物的显色时间分别为5 min 、10 min、15 min 、20 min ；以P/N值最大的反应时间为酶标二抗最佳稀释度和底物最佳反应时间。

1.9 阴阳性临界值的确定选取55份已知未感染PRRSV的阴性血清样本，以及1份已知感染PRRSV的阳性血清样本，以上述优化的ELISA检测条件检测，确定ELISA结果判定的临界值。判定方法选用Cut-Off值法，将OD450值转换成S/P值，计算出55份阴性血清的S/P平均值（x）和标准差（SD）。本文规定S/P（样本）≤x+2SD时为阴性S/P，S/P（样本）≥x+3SD时为阳性。当S/P（样本）值在二者之间为疑似，需要重新检测，如果检测结果S/P（样本）＜x+2SD时为阴性]，反之则为阳性。S/P=[OD450(样本）-OD450（阴性对照）]/[OD450(阳性对照）-OD450（阴性对照）]。

1.10 Nsp7α间接ELISA的特异性试验分别将伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒、阳性血清1∶40稀释，用上述建立的Nsp7α抗体ELISA检测方法进行检测，确定方法的特异性。

1.11 与IDEXX ELISA检测试剂盒符合率试验用IDEXX ELISA检测试剂盒检测血清样品115份，其中阳性血清53份，阴性血清62份，测试Nsp7α ELISA与IDEXX ELISA检测试剂盒符合率。

1.12 Nsp7α间接ELISA的重复性试验选取10份PRRSV抗体水平不同的血清，在相同的试验条件下，每份血清样本平行做8个重复，用上述建立的Nsp7α抗体ELISA检测方法进行检测，并对检测结果进行统计学分析。

2 结果

2.1 重组表达载体的鉴定以PRRSV DY 株cDNA为模板，PCR扩增获得大小为450 bp的Nsp7α片段，将该片段克隆到表达载体pET-32a(+)，用BamH Ⅰ、SacⅠ进行双酶切鉴定，酶切片段大小与预测一致（图1），且测序结果正确，说明重组质粒构建成功，将鉴定正确的重组载体命名为pET-Nsp7α。

图1 重组质粒pET-Nsp7α 酶切鉴定Fig.1 Identification of pET-Nsp7α restriction endonucleases

2.2 Nsp7α重组蛋白的表达纯化和鉴定在大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）中诱导重组蛋白表达，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，30℃条件下诱导表达5 h。菌体经超声破碎，分离上清和沉淀，SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白约为32 kDa，与预期大小一致，且在上清中表达（图2）。用His标签Ni-NTA亲和层析方法纯化目的蛋白（图3）。Western blot结果显示，纯化的蛋白能与PRRSV阳性血清反应，证明该蛋白具有良好的反应原性（图4）。

图2 pET-Nsp7α 的诱导表达结果Fig. 2 The induced expression of the expressed pETNsp7α

图3 Nsp7α 重组蛋白的纯化结果的重组Fig.3 The induced purification of the expressed recombinant proteins Nsp7α

2.3 Nsp7α重组蛋白ELISA检测方法的建立方阵试验表明，Nsp7α重组蛋白最佳包被浓度为1.0 μg/mL，最佳抗体稀释度为1∶40；经过对5%BSA、10%牛血清、5%牛血清、8%羊血清、10%脱脂奶粉5种封闭液进行测试，确定10%牛血清为最佳封闭液；稀释度分别为1∶2000、1∶4000、1∶6000、1∶8000、1∶10 000酶标二抗进行测试，最终确定酶标二抗的最佳工作稀释度为1∶4000；加入底物后显色时间分别5、10、15、20 min，确定最佳显色时间为37℃反应15 min；选取55份IDEXX试剂盒检测为阴性的血清样本以及1份阳性血清样本进行检测确定临界值。判定标准为：若S/P的比值＞0.32，则判定为抗体阳性；若S/P的比值＜0.26，则判定为抗体阴性；若0.26≤S/P的比值≤0.32，则判为可疑，需重新检测；若结果相同，则判为阳性。

2.4 Nsp7α ELISA的特异性试验用上述建立的ELISA检测方法进行特异性试验，分别将伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒和猪细小病毒阳性血清按照1∶40稀释，S/P值均小于0.26（表1），说明建立的ELISA方法特异性良好。

2.5 与商用试剂盒的符合率试验对115份临床样品分别用建立的方法与IDEXX ELISA检测试剂盒检测，其中阳性血清53份，阴性血清62份。结果表明，阳性符合率为94.34%（50/53），阴性符合率为93.54%（58/62），总符合率为93.91%（108/115）（表2）。

图4 Nsp7α 重组蛋白的Western blot 分析Fig.4 Western blot analysis of Nsp7α recombinanted protein

表1 Nsp7α ELISA 的特异性试验结果Table 1 Specificity test results of Nsp7α ELISA

表2 Nsp7α ELISA 与IDEXX ELISA 试剂盒检测结果的比较Table 2 Comparison of test results of Nsp7α ELISA and IDEXX ELISA kit

2.6 重复性试验结果应用本文所建立的Nsp7α抗体ELISA检测方法对10份不同PRRSV抗体水平的血清进行重复性检测，其变异系数均小于5%（表3），说明本文建立的Nsp7α抗体ELISA检测方法具有良好的重复性。

表3 重复性试验结果Table 3 Reproducibility test results

3 讨论

自上世纪80年代首次发现PRRSV至今，已经建立起多种针对PRRSV的诊断方法，主要有针对抗体检测的ELISA试验以及针对抗原检测的PCR、荧光定量PCR等。目前广泛使用的ELISA试剂盒，所包被的抗原主要以N蛋白为主，N蛋白具有良好的免疫原性，且血清抗体持续时间长[8]。利用非结构蛋白作为抗原进行ELISA检测，目前仍处于起步阶段，而Nsp7α的相关报导也较少。

Nsp7α在每个基因型中相对保守，但在基因型之间同源性不高[9]。氨基酸序列比较表明，Nsp7α在Ⅰ型PRRSV中具有96.7%～97.4%的氨基酸同源性，在Ⅱ型PRRSV中具有84.9%～100%的氨基酸同源性，但Ⅰ型和Ⅱ型基因型之间只有约45%的同源 性[10]，因此Nsp7α可以用于鉴别诊断PRRSV的Ⅰ型和Ⅱ型。Nsp7α在病毒的复制初期进行表达，并参与病毒的复制过程，且抗体免疫应答持续时间很 长[11]。

本研究通过原核表达系统成功纯化获得可溶性的Nsp7α重组蛋白及其多克隆抗体，可应用于免疫荧光试验，并具有较高的特异性及敏感性。以Nsp7α重组蛋白为抗原，建立了Nsp7α-ELISA抗体检测方法，并与IDEXX ELISA检测试剂盒对比，总符合率为93.91%，证明Nsp7α具有较高的准确性及敏感性，以此作为抗原来检测PRRSV是可行的。