乙醇降解菌种的筛选及其发酵乳产品 解酒功效评价

刘威良，毛瑞霞，王雪,2,，姬 昱，赵存朝，魏光强，黄艾祥

（1.云南农业大学食品科学技术学院，云南 昆明 650201；2.云南省畜产品加工工程技术研究中心，云南 昆明 650201）

饮酒过量或饮酒不当会造成乙醇在体内代谢产生许多有害物质及大量自由基，给人体造成很大伤害，长期饮酒不仅会造成大脑功能障碍和意识障碍，还会形成慢性乙醇中毒[1-3]。饮酒带来最大伤害的是肝脏，因为乙醇进入人体后90%以上是由肝脏代谢，而肝脏所产生的代谢产物及酒造成肝细胞代谢紊乱，是引起乙醇性肝损伤的主要原因[4-6]。我国古代著名医药学家李时珍所著的《本草纲目》中记载有：“凡酒醉不醒之人，用生葛根捣汁饮，方可解‘酒毒’”，可见葛根中含有一些解酒功效成分，具有一定的开发利用价值[7]。现代市售的解酒、醒酒产品发挥其功效多是基于该类产品在人体服用后能够影响乙醇代谢或抑制乙醇吸收[8-9]，但不能直接降解体内乙醇。很多醒酒药并没有实质的醒酒作用，只是起到安慰镇定、缓解头痛等作用，有些醒酒药虽具有一定解酒、醒酒功效，但也会伴随着不同的副作用，对人体健康不利。

微生物生长过程需要碳水化合物，若其可以利用乙醇作为碳源之一，就能起到降解乙醇的作用，但对于这方面的研究报道较少。因，本实验以前期确定的10 株发酵性能良好、食用安全的乳酸菌为出发菌种，通过乙醇耐受度、乙醇降解能力测定，筛选出具有较强乙醇降解能力的菌种，并以菌种与瑞士乳杆菌、嗜热链球菌互配，用牛奶、新鲜葛根、蔗糖为原料生产一种解酒发酵乳产品；进一步在体外模拟、肠液消化条件下分析该发酵乳产品对乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH）活性及抗氧化活性的影响，结合体内动物灌实验构建大鼠急性乙醇致肝损伤模型[10]，检测大鼠血液中乙醇含量及其对血清中谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）活性的影响，分析该发酵乳产品对肝细胞的保护作用，为后续解酒功能性产品的研发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验动物： S D 雄性大鼠4 0 只（ 体质量180～250 g），动物许可证号 SCXK（滇）2016-0002，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。

L-谷光甘肽 北京北纳创联生物技术研究院；1,1-联苯基-2-苦基肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS） 上海源叶生物科技有限公司；海王金樽片 海王健康科技发展有限公司；ADH 美国Sigma公司；MRS改良培养基、营养肉汤 广东环凯微生物科技有限公司；ALT测定试剂盒、AST测定试剂盒 南京建成科技有限公司。

1.2 仪器与设备

URA14M0018型分光光度计 上海翱艺仪器有限公司；TGL20M型高速冷冻离心机 湖南湘立科学仪器有限公司；SVJ-358型智能商用型酸奶机 北京世纪阳 光科技发展有限公司；SW-CJ-IF型单人双面超净无菌操作台 苏州江东精密仪器有限公司；HPX-9272ME型恒温培养箱 上海博讯实业有限公司；ZQLY-180S型振荡培养箱 上海知楚仪器有限公司；TRACE 1300型气相色仪、Tri Plus 300型顶空进器、Multiskan Go型酶联免疫检测仪 美国Thermo公司；GMSX-280型压力蒸汽灭菌器 北京市永光明医疗仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化

分别取适量乳酸菌菌株冻干粉接种于10 mL灭菌MRS肉汤培养基中，旋涡混匀，恒温培养箱中37 ℃培养24 h，得到1 代菌悬液。按10%的接种量将1 代菌悬液再接种于MRS肉汤培养基中，37 ℃恒温培养18 h，得到2 代菌悬液。重复上述步骤，37 ℃恒湿培养12 h，得到3 代菌悬液，4 ℃保存备用。

1.3.2 菌种驯化

将活化好的乳酸菌菌悬液接种到牛乳中进行驯化增殖，依次调整菌种接种量为8%、6%、4%、2%，40 ℃恒温培养至凝乳，需保证菌种活力能在4 h内凝乳。

1.3.3 乙醇耐受菌种的筛选

将稀释到适宜稀释度的10 株乳酸菌分别取0.1 mL接种于添加量为0%、10%、15%、20%无水乙醇的灭菌MRS改良培养基中[11-12]，每组3 个平行，用摇珠进行涂布，于37 ℃厌氧培养12 h。参照GB 4789.35ü 2010《食品微生物学检验 乳酸菌检验》进行乳酸菌总数测定，以活菌数为指标，筛选得到乙醇耐受菌种。

1.3.4 乙醇降解菌种的筛选

1.3.4.1 溶液配制

乙醇标准液：精密吸取无水乙醇适量，加入蒸馏水中，配成体积分数1%、2%、3%、4%、5%的乙醇标准液；重铬酸钾-硫酸溶液：取重铬酸钾1 g溶于25 mL水中，边搅拌边缓慢加入4 mL浓硫酸；乙醇富集培养液：取3%乙醇耐受菌液加入50 mL灭菌MRS改良培养基的三瓶中，于厌氧培养箱中37 ℃恒温培养8 h，使培养基中乙醇耐受菌充分富集，同时以MRS培养液为溶剂，分别配制20%、40%乙醇体积分数的MRS乙醇培养液，现配现用。

1.3.4.2 乙醇标准曲线绘制

向试管中分别加入0%、10%、20%、30%、40%、50%的乙醇标准液0.1 mL，每个试管中加入重铬酸钾-硫酸溶液1.0 mL，充分摇匀，盖好盖子；将试管置于沸水浴中10 min，使重铬酸钾-硫酸溶液充分氧化；取出试管，于610 nm波长处测定重铬酸钾-硫酸溶液的吸光度。以乙醇体积分数为横坐标，吸光度为纵坐标，制作乙醇标准曲线（y=0.162x0.002 3，R2=0.997 4），根据标准曲线计乙醇体积分数。

1.3.4.3 乙醇降解能力测定

参照高慧[13]的方法，分别取不同体积分数乙醇培养液5 mL于试管内，将筛选到的菌株200 µL接种于培养液内，混匀静置，37 ℃厌氧培养24 h。以不加菌液的MRS乙醇培养液作为对照，利用重铬酸钾-硫酸法测定乙醇残留量，分析各菌种的乙醇降解能力。

1.3.5 解酒发酵乳生产工艺流程

选用生产酸奶及发酵乳常用的基础菌种嗜热链球菌、瑞士乳杆菌与最佳的乙醇降解菌种嗜酸乳杆菌复配为发酵菌种，分别发酵牛乳和葛根液，再进行调配得到解酒发酵乳，具体流程如下：

1.3.6 解酒发酵乳体外功能活性分析

人工模拟肠液的配制：称取KH2PO46.85 g，加蒸馏水500 mL使其溶解，用0.4 g/100 mL NaOH溶液调节pH值至6.8，加水稀释，然后加入1 g/100 mL的胰蛋白酶，加水使其充分溶解，定容至1 L，混匀备用。

1.3.6.2 解酒发酵乳对ADH活性的影响

1.3.6.3 解酒发酵乳的体外抗氧化活性

1.3.7 解酒发酵乳体内功能活性分析

1.3.7.1 解酒发酵乳对醉酒大鼠体内乙醇含量的影响

雄性大鼠40 只，随机分为4 组，每组8 只，分为对照组、海王金樽组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，确保各组老鼠体质量无显著性差异（P＞0.05）。各组大鼠禁食16 h后，用16 mL/kg剂量的白酒进行灌。以翻正反射消失为醉酒指标，达到醉酒状态后进行解酒发酵乳灌，低、中、高剂量组的解酒发酵乳灌量分别为1.5、3、6 mL/kg，对照组以灌生理盐水为空白对照、灌解酒药物海王金樽为阳性对照。灌后，灌酒1 h采用大鼠眼内眦取血（用定量毛细管吸取一定体积血液），灌入解酒发酵乳后1、2、3 h分别取全血，采用顶空气相色法[16-17]测定乙醇含量，分析解酒发酵乳对醉酒大鼠体内乙醇的降解能力。

1.3.7.2 解酒发酵乳对醉酒大鼠肝损伤的保护作用

1.3.8 测定方法

1.3.8.1 ADH激活率测定

采用瓦勒-霍赫法[20-21]测定ADH活性。吸取焦磷酸钠缓冲液1.5 mL、NAD1.0 mL、乙醇溶液0.5 mL和品0.1 mL相混合，25 ℃加盖温浴5 min后，立即加入ADH溶液0.1 mL并摇匀，用分光光度计测定340 nm波长处的吸光度，以后每隔10 s读数一次，连续测定5 min。以不加品的反应组为空白对照，以吸光度对时间作曲线图，取反应液最初组分，计在340 nm波长处吸光度每10 s的增加值，再根据NADH在340 nm波长处的摩尔消光系数为6.2，计酶活性。ADH活性以每分钟NADH生成物质的量（nmol）表示，ADH激活率计如式（1）所示：

1.3.8.2 DPPH自由基清除能力测定

参照曾丽等[22]方法，分别吸取处理方式不同的解酒发酵乳的等量上清液，加入31 µg/mL DPPH溶液，充分振摇后，室温下暗处放置0.5 h，于517 nm波长处测定吸光度。以谷光甘肽为标准品，绘制标准曲线回归方程为y=0.017 1x0.318 6（6.4～38.4 μg/mL，R2= 0.992 5）；y为DPPH自由基清除率，x为谷光甘肽质量浓度（μg/mL）。DPPH自由基清除率计如式（2）所示：

式中：A1为实验组吸光度；A2为品干扰实验吸光度（调零）；A3为DPPH-甲醇溶液吸光度；A4为蒸馏水吸光度（调零）。

1.3.8.3 ABTS阳离子自由基清除能力测定

参照黄佳琦[23]、Agrawal[24]等方法并进行修改。分别吸取处理方式不同的解酒发酵乳的等量上清液，加入ABTS稀释工作液3.8 mL，室温下反应6 min，于734 nm波长处测定吸光度。以谷光甘肽为标准品，绘制标准曲线回归方程为y=0.010 9x0.057 6（9.6～57.6 μg/mL，R2=0.992 6）；y为ABTS阳离子自由基清除率，x为谷光甘肽质量浓度（μg/mL）。ABTS阳离子自由基清除率计如式（3）所示：

式中：A1为实验组吸光度；A2为品干扰实验吸光度（调零）；A3为ABTS工作液吸光度；A4为蒸馏水吸光度（调零）。

1.3.8.4 大鼠全血中乙醇含量测定

标准曲线制作：分别取0、0.1、0.2、0.4、0.8 mL的乙醇标准储备液（200 mg/100 mL）于10 mL顶空瓶中，加入空白组血液至1 mL，配制成质量浓度为0、20、40、80、160 mg/100 mL，混匀后置于顶空装置中70 ℃恒温30 min，自动进上层气体1 mL，以保留时间定性，以面积定量，以乙醇质量浓度（mg/100 mL）为横坐标，面积（mV）为纵坐标绘制标准曲线。

1.4 数据统计分析

采用Excel 2003软件进行数据处理分析，结果以f s表示，统计学差异分析方法采用ANOVA的Tukey方法， P＜0.05，差异显著。

2 结果与分析

2.1 乙醇降解菌种的筛选

2.1.1 乙醇耐受菌筛选

表 1 10 株乳酸菌在不同乙醇体积分数下培养12 h的活菌数变化Table 1 Changes in viable cell count of 10 Lactobacillus strains cultured at different ethanol concentrations for 12 h

实验前期通过发酵性能测定选取嗜热链球菌、瑞士乳杆菌、植物乳杆菌等10 株发酵性能良好且食用安全的菌株，在15%、20%乙醇体积分数下测定其对乙醇的耐受度。由表1可知，副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌3 株菌相比其他7 株乳酸菌，在2 种乙醇体积分数下的活菌数较多，其中以嗜酸乳杆菌的存活数最多，可能是3 株菌自身带有相关乙醇耐受基因[25-26]，在含有乙醇的环境下依然能够较好的生长，具有较好的乙醇耐受能力。

2.1.2 乙醇降解菌筛选

通过乙醇耐受度测定得到1 株乙醇耐受效果最明显的菌种嗜酸乳杆菌。由图1可知，在20%乙醇体积分数下，嗜酸乳杆菌乙醇降解效果最好，培养24 h后乙醇为10%左右，副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌次之，其他菌株变化不明显；在40%乙醇体积分数下，嗜酸乳杆菌的乙醇降解效果也是最好，培养24 h后乙醇降为15%左右，副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌次之，降解效果均没有嗜酸乳杆菌明显。由表明，在20%、40%乙醇体积分数下，嗜酸乳杆菌能够有效利用乙醇作为碳源之一，从而发挥降解乙醇的作用[27]。因，最终选取嗜酸乳杆菌作为最佳的乙醇降解菌种。

图 1 20%（A）和40%（B）乙醇体积分数下菌种的降解效果Fig. 1 Ethanol degradation ability of 10 strains at 20% (A) and 40% (B) ethanol concentration

2.2 解酒发酵乳的体内外功效评价

表 2 模拟胃、肠液消化条件下ADH激活率测定Table 2 ADH activation rates of fermented milks in simulated gastrointestinal tract

表 3 模拟胃、肠液消化条件下自由基清除能力 Table 3 Free radical scavenging capacities of fermented milks in simulated gastrointestinal tract μmol/mL

2.2.3 解酒发酵乳对醉酒大鼠体内乙醇含量的影响

图 2 灌入解酒发酵乳前后大鼠血液中乙醇含量变化Fig. 2 Change in blood alcohol concentration of alcohol-drinking rats at different times after oral administration of fermented milk

2.2.4 解酒发酵乳对醉酒大鼠肝损伤的保护作用

血清酶学中对ALT和AST的检查是诊断肝损伤的重要指标，肝细胞发生实质性损害时，细胞膜通透性改变，胞内的ALT和AST释放至血液中，导致血中酶活性 偏高[32]。正常肝脏组织中转氨酶含量是血液的100 倍，当肝脏出现实质性损伤时，若出现1%的肝细胞坏死状况，血清中的转氨酶活性即提高数倍，所以AST和ALT活性是考察肝损伤的敏感性指标[33]。

图 3 灌入解酒发酵乳前后大鼠血清中AST（A）、ALT（B）活性变化Fig. 3 Changes in serum AST (A) and ALT (B) activity in rats at different times after oral administration of fermented milk

如图3所示，与空白对照组相比，大鼠灌酒1 h后分别灌入低、中、高剂量的解酒发酵乳，在3 个时间段大鼠血清中AST和ALT活性均显著降低，且呈现剂量依赖性，阳性对照组后3 个时间段血清中AST和ALT活性均高度显著（P＜0.001）。其中，中、高剂量组分别在2、3 h后大鼠血清中AST和ALT活性出现明显下降（P＜0.001），尤其在3 h远低于空白对照组、略高于阳性对照组，可能是因为解酒发酵乳中的乙醇降解菌和葛根发生了协同作用，有效缓解大鼠肝细胞发生实质性损害，从而抑制了胞内ALT和AST的释放[34]。由表明，解酒发酵乳对乙醇致肝损伤有较好的保护作用，降低动物血清中AST和ALT活性，可有效预防肝细胞因乙醇过度刺激导致的坏死。

3 结 论

过量饮酒会使乙醇在人体内代谢产生有害物质及大量自由基，为缓解过量饮酒对人体造成的伤害，本实验以前期确定的10 株发酵性能良好、食用安全的乳酸菌为出发菌种，通过乙醇耐受度、乙醇降解能力测定，筛选出具有高效乙醇降解能力的嗜酸乳杆菌，并以菌种与瑞士乳杆菌、嗜热链球菌互配，用牛奶、新鲜葛根、蔗糖为原料生产出一种解酒发酵乳产品。该发酵乳产品在体外模拟、肠液消化条件下，能使ADH激活率分别达到（36.87f 1.58）%、（33.64f 1.90）%，ABTS阳离子自由基清除能力分别为（1 293.72f 4.12）、（729.98f 21.37）μmol/mL，DPPH自由基清除能力分别为（16.14f 0.12）、（11.26f 0.10）μmol/mL；大鼠体内灌不同剂量的解酒发酵乳均能降低血液中乙醇含量，尤其是高剂量组3 h后降为51.62 mg/100 mL（P＜0.001），并能不同程度地降低大鼠血清中ALT和AST活性且呈剂量依赖性，对乙醇所致肝损伤有较好的保护作用。该研究可为后续解酒功能性产品的研发提供一定的科学依据。