等离子体处理技术促进高分子聚合物在骨组织工程中的应用综述

李 明，刘建恒，崔 翔，张里程，唐佩福

解放军总医院第一医学中心 骨科，北京 100853

严重创伤、感染、肿瘤及骨骼肌肉系统先天性畸形所导致的骨缺损日趋增多，骨缺损后修复重建成为骨科医生面临的巨大挑战。当前治疗的主要方法为骨移植，据统计美国每年因创伤及骨不连术后进行骨移植治疗的患者高达100 万例[1]，我国每年因先天性疾病、交通伤及运动损伤等导致的骨缺损高达400 万例[2]。作为治疗金标准的自体骨移植，因其来源有限及供区并发症因素，难以满足当前临床的巨大需求[3]。应用骨组织工程支架作为骨移植材料，为骨缺损的修复提供了新的方法。理想的骨移植物材料应具备良好的生物相容性、骨传导性、骨诱导性、可吸收性或可降解性，并具有一定的力学性能为骨缺损部位提供临时支撑[4]。随着合成方法的进步和修饰手段的多样化，高分子聚合物不但具备高度三维多孔的微观结构，而且修饰后可显著增加生物相容性，为新生骨组织的生长和血管化提供了有力保障[5-7]。等离子体表面改性技术不仅通过蚀刻、化学反应和离子辐射等方法改变了高分子聚合物表面的组成和微观结构，还可以通过涂层、嫁接和蛋白质固定等手段制造仿生表面结构，且不会影响高分子聚合物的内在性质[8]。因此，本文就等离子体表面改性技术及其改性效果，促进高分子聚合物在骨组织工程中的应用进行综述，为骨移植材料促进骨缺损修复重建提供借鉴。

1 等离子体简介

等离子体(plasma)由Langmuir 于1928 年首次提出，用来描述多组分相互作用的气体在放电管里的物质形态[9]。等离子体是借电场或磁场的高动能将外层的电子击出，将原子转化为带电荷的离子，成为高位能、高动能的一种电离气体团[10]。等离子体常被称作为物质的第四种形态，主要由电子、带正电或负电的离子、自由基、电磁辐射、分子及分子碎片等组成。因此，等离子体是集能量和反应物质共存的混合物，其重要的特征是处于带电平衡状态，即等离子体的总带电量为中性[11-12]。因此，为了获得气体的等离子体状态，必须要在电离过程中传输能量，以获得足够的动能激发电离。产生等离子体需具备三个要素，即电离的能量、维持等离子体状态的真空系统和离子体反应室[13]。气体源性的等离子体产生是将气体置于真空的等离子体反应器中，通过施以低电流、高压放电的方式激发电离原子和分子级联，进而产生非热性的等离子体，如射频辉光放电、电晕放电和大气电弧等[14]。因其技术成熟，效果显著且操作简便，在生物、物理和化学等领域得到了广泛的应用，成为近年来医学工程领域的研究热点。

2 应用等离子体技术进行表面改性修饰

高分子聚合物表面的亲水性差，缺乏自然识别位点，限制了其在骨组织工程领域的应用。表面修饰技术可有效改变材料的表面性质如粗糙度、形貌、电荷、化学成分、表面能和湿润性，进而有效地促进高分子聚合物与组织的相互作用[15-17]。等离子体中的活性物质如自由基、离子、受激发的原子、分子和电磁辐射等，在不对材料本身进行损害的基础上灭活微生物和病毒，并可以在不使用化学溶剂或产生有毒废物的情况下活化材料表面进而增加其生物相容性。此外改性的材料表面在受到更高的能量时会发生链断裂反应，通过共价键形成新的化学构型和化学功能，进一步促进材料与宿主之间相互作用，增强细胞的黏附增殖，提高材料的生物活性[18]。

根据等离子体表面反应类型，主要分为以下四类：1)溅射蚀刻效应；2)功能化活性位点的引入；3)自由基的嫁接和聚合反应；4)沉积涂层[19-20]。溅射蚀刻效应通过原子、分子和受激发物质的物理轰击于材料表面进行蚀刻，侵蚀程度主要取决于等离子源的输入功率、反应时间和施加电压等。材料表面形态通常是纳米级的改变，表面形态的改变会增加材料的表面积，从而影响生物界面反应，增强生物相容性[21]。引入功能化活性位点分为两种形式，一种是以惰性气体通过自由基形式引入活性位点，另一种是以强氧化气体和高反应性气体通过官能基团形式引入化学功能位点。功能化活性位点既可以改变材料表面亲水性能，又可以基于此进一步修饰改性[22]。自由基和官能基团接触液相或气相单体时引发聚合反应，新形成的嫁接表面为化学共价修饰提供了反应位点，如化学交联、大分子与生物分子静电相互作用等[23]。沉积涂层通常采用化学气相沉积法在材料表面形成一层纳米级厚度的涂层，其性质、厚度、强度、光滑度和亲水性均会改善聚合物材料的生物相容性[24]。

3 高分子聚合物的表面性能在生物反应中的重要性

生物材料暴露于生物体内时，材料表面与体液或血液接触后吸附蛋白质与细胞受体相结合，诱导细胞的黏附、增殖和分化。因此材料表面的组成、结构及吸附蛋白的成分决定了与之接触细胞的生物学行为[25]。通常细胞与材料的相互作用分为非特异性和特异性两类[26]。非特异性相互作用是通过对材料表面化学成分、表面能量、粗糙度和形态进行修饰，增加非特异性蛋白的吸附并保持吸附蛋白的生物活性，进而诱导细胞行为。但非特异性作用在促进细胞增殖分化的同时可能损害细胞活性导致细胞死亡。以炎症反应为例，当生物材料被植入体内几秒后便会在表面吸附一层蛋白，诱导中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞等黏附并发出细胞因子召集成纤维细胞合成胶原蛋白，最终在生物材料周围形成一层纤维组织[27]。特异性相互作用通过在材料表面直接固定特异性配体蛋白诱导细胞产生特异性的反应。骨组织工程中常在材料表面负载骨形态发生蛋白，诱导细胞成骨分化促进骨形成[28]。

4 等离子体修饰提高高分子聚合物的生物相容性

等离子体修饰提高聚合物生物相容性主要有两种方式：一是通过等离子体修饰技术提高材料表面亲水性、引入活性基团、增加材料表面粗糙度、改变表面电荷；二是在等离子体修饰基础上固定生物反应活性分子，增强生物识别能力。材料界面自由能决定了亲/疏水性能，低表面能的材料上细胞的黏附性较差且数量相对较少。Rattier等[29]发现生物材料表面能为20 ～ 30 mJ/m2时无黏附性能，在40 ～ 70 mJ/m2时具有良好的黏附特征。等离子体通过在聚合物表面引入羧基(-COOH)、过氧化物(-O-O-)、羟基(-OH)、氨基(-NH3)基团和极性物质，引起极性基团重新排列和非极性基团表面迁移，增加材料表面能，促进体液血液的接触反应和细胞的黏附固定。高分子聚合物材料经等离子体蚀刻后形成微米至纳米级的沟槽样粗糙表面，细胞接触后沿粗糙面扩散、排列和迁移。该现象被称为“接触引导作用”，即细胞整合素受体根据所接触的不同表面形态，将张力或压力的变化转移至细胞骨架，细胞牵张感受器承受力量变化后激活重组细胞骨架，从而引起系列生物学效应，同时由于材料表面区域结构破坏导致表面自由能的变化，协同影响了细胞的黏附迁移[30]。不同的粗糙表面对细胞的影响也取决于细胞类型、材料组成及两者间的相互作用。研究证实表面沟壑(深度0.5 ～ 1μm，宽度1 ～ 10μm)可有效增强大鼠骨髓细胞碱性磷酸酶活性并加速细胞外基质矿化[31]。此外，等离子体处理后材料表面可产生广泛分布的阴阳离子、官能团、自由基等。阳离子通过静电相互作用促进蛋白的黏附，阴离子与钙离子结合促进细胞外基质矿化[32]。为了进一步增加反应的特异性，材料表面引入羟基、羧基、氨基等反应基团作为偶联位点，通过化学接枝和涂层技术共价连接蛋白，如黏附蛋白可通过配体受体相互作用促进细胞黏附，生长因子调节细胞增殖、分化。引入亲水性高分子和生物大分子进行非共价改性，并基于带相反电荷的聚阴离子和聚阳离子交替沉积形成静电自组装涂层，通过聚电解质多层膜控制细胞黏附。此外，羟基磷灰石作为骨基质的主要矿物成分，在骨修复过程中对骨组织再生具有重要作用，将高分子聚合物经等离子体表面改性后浸润至模拟体液，引发磷酸钙沉积，形成的仿生磷灰石涂层被证实可提供良好的骨传导性和骨诱导性[33]。

5 等离子体修饰的高分子聚合物在骨组织工程研究中的应用

高分子聚合物如聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物和聚己内酯等，在体内分解成乳酸和乙醇酸后排出体外。因其独特的结构、可控性、可降解性和可重复生产等优势，在骨组织工程领域得到了广泛的应用，并获得FDA 的批准[34-35]。Wang 等[36]3D 打印了聚乳酸支架并进行空气等离子体修饰，发现支架表面粗糙、亲水性增加，并证实其有效促进成骨细胞和间充质干细胞的附着和增殖。Castillo-Dali 等[37]制备了氧气等离子体修饰复合二氧化钛纳米颗粒的聚乳酸-羟基乙酸功能化膜，将其用于兔颅骨缺损中，证实该功能化膜有效促进了新骨形成和骨基质矿化。Kook 等[38]证实随着氧气等离子体刻蚀时间的增加，聚己内酯支架表面的粗糙度和亲水性也随之增加，进而有效提高了成骨前细胞分化并促进兔颅骨缺损处新骨形成。Domingos 等[39]3D 打印了聚己内酯多孔支架并采用混合乙烯/氮气进行等离子处理，将形成含氮基涂层的支架与Saos-2 成骨细胞共培养，发现成骨细胞均匀定植于多孔材料且具有显著的黏附和增殖能力。Declercq 等[40]将聚己内酯支架经氧气等离子修饰后嫁接明胶和纤连蛋白，有效促进人脂肪组织来源干细胞的增殖和成骨分化。Roh 等[41]构建了负载氧化镁纳米颗粒的聚己内酯和羟基磷灰石复合材料，并用氧气和氮气等离子体处理后与成骨前体细胞共培养，证实等离子体处理结合氧化镁及羟基磷灰石后增强了支架中细胞的黏附、增殖和分化。但是当前研究多为体外验证，针对其体内修复效果，特别是大段骨缺损的重建还有待研究。随着技术的进一步改进，基于等离子体修饰的复合仿生高分子聚合物将成为治疗骨缺损简单有效的手段。