朱顶红鳞茎组织培养中的抗褐化研究*

廖焕琴 钟敏艳 徐 放 杨会肖 杨晓慧 陈新宇 张卫华 潘 文 徐 斌

（1.广东省森林培育与保护利用重点实验室/广东省林业科学研究院，广东 广州 510520；2.广东药科大学，广东 广州 510006）

朱顶红（Hippeastrum rutilum），别名孤挺花、华胄兰等，为石蒜科（Amaryllidaceae）朱顶红属（Hippeastrum）多年生草本植物，原产于秘鲁巴西一带，花茎挺拔，花朵硕大，花色艳丽，观赏价值高，深受国内外消费者喜爱。相关研究表明朱顶红及其分离的化学成分具有抗菌、抗病毒和抗肿瘤等功效，药理作用丰富[1-2]。

朱顶红常用的繁殖方法主要有自然分球、扦插和播种等，但是繁殖速度慢，难以满足市场的需求。而采用组织培养技术进行离体快繁，具有繁殖系数高、成苗时间短和便于商品化和产业化生产的优势[3]。近年来研究者对朱顶红组织培养进行了一系列研究。邹水平等[4]、邵素娟等[5]、张亚玲等[6]、高年春等[7]以鳞茎作为外植体建立组培体系。张慧等[8]、于波等[9]、王春夏等[10]报道了以朱顶红花梗和叶片等器官作为外植体成功获得无菌苗。张梦迪[11]、黄敏[12]、Mujib A 等[13]就培养基类型、生长调节物质含量等方面进行组培体系的优化。朱顶红鳞茎在组织培养过程中的褐化问题影响增殖速度，从而制约工厂化生产效率，但目前朱顶红褐化相关研究鲜有报道，因此，研究朱顶红抗褐化研究具有十分重要的意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验以广东林业科学研究院组培中心长势良好、色泽翠绿的朱顶兰继代苗为试验材料。

1.2 试验方法

1.2.1 基本培养基 分别配制以下培养基：（1）MS+2.0 mg·L-16-BA+30 g·L-1蔗糖+6 g·L-1卡拉胶；（2）1/2MS+2.0 mg·L-16-BA+30 g·L-1蔗糖+6 g·L-1卡拉胶；（3）KC+2.0 mg·L-16-BA+30 g·L-1蔗糖+6 g·L-1卡拉胶；（4）LS+2.0 mg·L-16-BA+30 g·L-1蔗糖+6 g·L-1卡拉胶；（5）B5+2.0 mg·L-16-BA+30 g·L-1蔗糖+6 g·L-1卡拉胶，调pH 至5.8-6.2，共5 个处理，每个处理重复3次。在培养基上接种朱顶红鳞茎，纵向切割，一分为二，培养温度25 ℃，2 000 lx，光照12-16 h，培养30 d 后，观察朱顶红的褐变状况及生长状况，筛选适合的基本培养基。

1.2.2 低pH 水培 按胡庆等[14]配制4×（倍），6×（倍）和8×（倍）的不同离子强度的缓冲液。配制以下培养基：（1）MS+2.0 mg·L-16-BA+30 g·L-1蔗糖+6 g·L-1卡拉胶+缓冲液4×（倍）；（2）MS+2.0 mg·L-16-BA+30 g·L-1蔗糖+6 g·L-1卡拉胶+缓冲液6×（倍）；（3）MS+2.0 mg·L-16-BA+30 g·L-1蔗糖+6 g·L-1卡拉胶+缓冲液8×（倍）。共3 个处理，每个处理重复3 次。以增殖阶段的朱顶红无菌苗为试验材料，纵向切割，一分为二，培养温度25 ℃，2 000 lx，光照12-16 h，培养30 d 后，观察朱顶红的褐变状况及生长状况。

1.2.3 凝固剂种类、浓度和糖浓度 以MS+2.0 mg·L-16-BA 为培养基，凝固剂为卡拉胶、琼脂粉A 和B 3 种，凝固状态为液体、半固体和固体3 种，蔗糖为10，20，30 g·L-13 个浓度。采用正交试验设计L9（34），各实验因素及水平见表1，共9 个处理，每个处理重复3 次。以生长状态一致的朱顶红鳞茎为试验材料，纵向切割，一分为二，培养30 d 后，观察朱顶红鳞茎的褐变状况及生长状况。1.2.4 抗褐化剂 在MS+2.0 mg·L-16-BA +卡拉胶6 g·L-1+蔗糖30 g·L-1培养基中分别添加不同种类和浓度的抗褐化剂：活性炭（AC），0、0.1、0.5、1.0 g·L-1、聚乙烯吡咯烷酮（PVP），0、0.5、1.0、2.0 g·L-1，维生素C（VC），0、0.1、0.3、0.5 g·L-1、柠檬酸（CA），0、0.1、0.3、0.5 g·L-1，调pH 为5.8-6.2。以增殖阶段的朱顶红无菌苗为试验材料，纵向切割，一分为二，培养温度25 ℃，2 000 lx，光照12-16 h，每个处理重复3 次.培养30 d 后，观察朱顶红的褐变状况及生长状况。

表1 不同种类和浓度凝固剂及糖浓度的因素水平Tab.1 Type and concentration of coagulant, concentration of sucrose

1.3 统计方法

观测指标为鳞茎褐化程度、培养基状况、鳞茎生长状况和增殖率。褐化等级划分：＋，外植体无褐变，周围培养基呈半透明状；＋＋，外植体轻度褐变，切口处渗出褐色物质，周围培养基少许变色；＋＋＋，外植体中度褐变，切口处渗出褐色物质，周围培养基小范围变色；＋＋＋＋，外植体较严重褐变，切口处渗出褐色物质，周围培养基大范围变色；＋＋＋＋＋，外植体严重褐变，切口处渗出褐色物质，周围培养基大范围深度变色。增殖率计算公式为：增殖率=接种后球数/接种前球数。

1.4 数据分析

试验数据采用R3.6.3 软件进行统计学分析，采用Duncan 法进行多重比较检验。

2 结果与分析

2.1 基本培养基对朱顶红继代培养的影响

由表2 可知，朱顶红鳞茎继代培养30 d 后，MS 培养基中褐化程度最低，鳞茎轻度褐变，切口处渗出褐色物质，周围培养基小范围变浅黄色，植株生长状况良好，叶绿有光泽且较宽大，无黄叶，鳞茎粗壮且内部紧实，其次是1/2MS、B5、KC 培养基；LS 培养基中朱顶红鳞茎褐化程度最高，随植株生长褐化越来越严重，周围培养基变为深褐色，叶色逐渐变成黄色，鳞茎较粗壮但内部较疏松，有玻化现象，随培养时间延长植株逐渐死亡。总体而言，MS 培养基宜作为基本培养基继续进行朱顶红鳞茎抗褐化研究。

表2 不同基本培养基对朱顶兰继代培养的影响Tab. 2 Effects of different basic medium on subculture of Hippeastrum rutilum

2.2 低pH 水培对朱顶红继代培养的影响

由表3 可知，与对照组（CK）相比，在不同酸度和离子强度的培养基上，植株褐化严重，所有处理增殖效果不好，增殖率最高仅为1.78，生长状况差，植株逐渐枯萎死亡。综上所述，低pH水培不适合朱顶红的组织培养。

表3 低pH 水培对朱顶红继代培养的影响Tab. 3 Effects of low pH ydroponic culture on subculture of Hippeastrum rutilum

2.3 凝固剂种类、浓度和糖浓度对朱顶兰继代培养的影响

从表4 中植株褐化程度和培养基状况来看，处理4 和5 抗褐化效果较好，植株鳞茎轻度褐变，周围培养基呈半透明状态；处理5 植株鳞茎生长快，粗壮，无玻化现象，叶浅绿，宽大且无黄叶，长势较好，而处理4 鳞茎玻化现象严重，生长状况一般；在所有处理中，处理9 抗褐化效果最差，植株鳞茎重度褐变，周围培养基颜色扩散范围较大，呈褐色，生长状况也较差，鳞茎弱小且玻化严重。因此处理5 抗褐化效果最理想。

表4 不同种类和浓度凝固剂及糖浓度对朱顶红继代培养的影响Tab. 4 Effects of different type and statue of coagulant, different concentration of sucrose on subculture of Hippeastrum rutilum

从表5 中增殖率可知，处理5 增殖率最高，达到4.11，其次为处理3、处理7 和处理9，增殖率分别为4.0、3.89 和3.78，四者之间无显著性差异，但处理5 与其他五个处理间差异显著；从极差分析看，蔗糖浓度的极差最大，达到1.036，对朱顶红鳞茎的增殖率影响最大，3 种因素对朱顶红鳞茎增殖率作用的主次顺序为蔗糖浓度＞凝固剂种类＞凝固剂浓度；方差分析结果表明,蔗糖浓度对朱顶红鳞茎增殖率的影响达极显著水平（P＜0.05），而凝固剂类型和凝固剂浓度对朱顶红鳞茎增殖的影响都不显著。总体而言，处理5 即MS+2.0 mg·L-16-BA +30 g·L-1蔗糖+1.8 g·L-1琼脂粉A 适合朱顶红鳞茎组织培养。

表5 不同种类和浓度凝固剂及糖浓度对增殖率的影响Tab. 5 Effects of different type and concentration of coagulant, different concentration of sucrose on proliferation rate

2.4 抗褐化剂对朱顶红继代培养的影响

由表6 可知，CK 处理中不添加抗褐化剂，朱顶红鳞茎褐变较为严重，渗出较多黄色物质于培养基中，培养基呈黄色，植株长势一般，随AC 浓度增加朱顶红鳞茎褐变逐渐减轻，培养基由浅黄至透明，在活性炭浓度为1.0 g·L-1，叶色呈绿有光泽，鳞茎生长较快和粗壮，无玻化，无黄叶出现，长势良好，增殖率最高值为处理4 达到 4.58；朱顶红鳞茎随PVP 浓度增大褐变程度增加，当PVP 浓度为0.5 和1.0 g·L-1时表现出较高的增殖率，分别为4.5 和4.25，当浓度增至2.0 g·L-1时培养基中出现大量黄褐色物质，植株长势很差；在添加VC 和CA 的培养上朱顶红鳞茎生长状况一般，且玻化严重。综上所述，在继代培养基中添加1.0 g·L-1活性炭可有效抑制朱顶红鳞茎的褐化。

表6 不同种类和浓度抗褐化剂对朱顶红继代培养的影响Tab. 6 Effects of different anti-browning agent on subculture of Hippeastrum rutilum

3 结论与讨论

植物组织培养过程中所需的营养皆来自培养基，且不同的基本培养基其营养成分与含量有所不同。因此，选择适合的基本培养基对朱顶红继代培养的顺利进行尤为重要。近年来学者们对朱顶红组织培养的适宜培养基进行了探讨，但得出来的结论不尽相同[15]。本次试验结合褐化现象和生长状况来看，朱顶红鳞茎在MS 培养基上抗褐化效果较KC、1/2MS、LS、B5 好，而李静[16]发现1/2MS 培养基更有利于继代和壮苗培养。

在植物组织培养中，pH 值会影响植物的褐变、生长与增殖。试验结果表明低pH 水培（pH为3.2）并不能抑制朱顶红鳞茎的褐化，且不利于朱顶红的生长与增殖。

在凝固剂种类、浓度和糖浓度的正交试验中，所用凝固剂由不同公司所提供，可能由于其成分和来源有所不同，导致植物在组培过程其生长状况不同。在本试验中，从朱顶红鳞茎抗褐化效果、生长状况和增殖率来看，添加琼脂粉A 和30 g·L-1蔗糖效果最佳，但就成本而言，以卡拉胶为凝固剂，添加适量活性炭抑制褐化较低廉，宜推广用于工厂化生产。

在组织培养过程中最理想的抗褐化剂是既能控制褐化又不影响植物的正常生长。在本试验中AC 表现出良好的抗褐化作用，且不影响增殖，这与王培军[17]研究结果相似。添加PVP 后鳞茎抗褐化效果差，且植株长势差，但浓度为0.5 和1.0 g·L-1时增殖率分别达到4.25 和4.5，因此在筛选适宜的抗褐化剂时，应实现抗褐化效果、增殖和生长状态三者之间的平衡。