木丹颗粒对高糖环境下人血管内皮细胞Nrf2/ARE信号通路的影响

李可月 ，李 都，王 镁

(1.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110032；2.辽宁中医药大学附属医院内分泌科，辽宁 沈阳 110032)

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是糖尿病常见的并发症之一[1]，作为缺血性心脑血管疾病的病理基础，AS的防治对糖尿病患者临床二级预防有着重要的意义。其发病机制之一血管内皮氧化应激学说被学者广泛认同[2]。核转录因子E2相关因子2(neclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)/抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)信号通路是近年来发现调控氧化应激的重要信号通路，通路中Nrf2及血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)等均具有明显的抗氧化应激作用[3]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的过度表达，使血管内皮细胞病理增生，对血管内皮产生的损伤，可使AS进一步发展[4]。已有研究发现木丹颗粒对糖尿病患者AS有干预作用[5]。本研究在此基础上观察木丹颗粒对高糖环境下人血管内皮细胞Nrf2/ARE信号通路及血管内皮生长因子VEGF表达的影响，并进一步探讨木丹颗粒对糖尿病AS的影响是否与Nrf2/ARE信号通路抗氧化应激、减少VEGF含量有关。

1 材料

1.1 动物 SPF级6周龄雄性Wistar大鼠30只，体质量(230±20)g，生产许可证号：SCXK(辽)2015-0001，于辽宁长生生物技术有限公司采购。此实验已通过辽宁中医药大学实验动物伦理委员会批准(编号：20161202)，操作步骤均符合中国伦理委员会动物研究相关指导原则。

1.2 细胞 人血管内皮细胞株(货号 4200)：广州吉妮欧生物科技有限公司，美国Sciencell研究实验室。

1.3 试剂 RPMI 1640培养基、PBS缓冲液(批号 10040586R、AB10115027)：Hyclone公司；Trizol试剂(批号 14105)：Invitrogen公司；胎牛血清(批号 1108862)：Gibco公司；兔源β-actin一抗(批号 4970)：Cell Signaling公司；Prime Script®RT Reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒、SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)、ROX Plus试剂盒(批号 RR047A，RR82LR)：Takara公司；人VEGF酶联免疫检测试剂盒(批号 AE98006Hu)：AMEKO公司；SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒、BCA蛋白浓度试剂盒(批号 P0019、P0018A、P0012AC、P0012S)：碧云天生物技术有限公司；显影定影试剂盒；特超敏ECL化学发光试剂盒。

1.4 仪器 MCO-15AC型细胞培养箱：Sanyo公司；SW-CJ-1CU超净工作台：苏州净化设备有限公司；MR1822型低温高速离心机：Jouan SA公司；INFINITE M200型多功能酶标仪：TECAN公司；DU640型蛋白核酸分析仪：Beckman公司；DYY-12型电泳仪、DYCP-40C型转移电泳仪：北京六一仪器厂；Stratagene Mx3000P型荧光定量PCR仪：Agilent公司；Chemi Imager 5500型凝胶成像分析系统：Alphainnotech Chemi Imager公司。

1.5 药物 木丹颗粒(准字号z20080033)：营口奥达制药有限公司。

2 方法

2.1 细胞培养 解冻人血管内皮细胞株，完全溶解复苏后将其配制成细胞悬液，在96孔板及培养瓶中分种，将温度设置成37 ℃恒温，在浓度为5%的CO2饱和湿度培养箱中培养24 h，然后吸除、弃去细胞培养液及未贴壁细胞，更换培养液，在细胞呈单层贴壁生长后延长至每2～3 d换液，多次换液培养至细胞生长融合达80%。

2.2 细胞传代 从培养箱中取出培养瓶，吸除瓶内培养液并重复用PBS洗去残留培养液2次，加入1 mL室温胰蛋白酶，晃动培养瓶1～3 min后放至显微镜下，观察细胞生长情况，当细胞间隙变大，胞质回缩变圆时，立即拿入超净工作台加适量胎牛血清培养液以结束消化。采用无菌吸管轻轻吹打贴壁细胞表面，制细胞悬液，转速1 800 r/min离心机进行离心，10 min后结束，弃去上清，加入适量培养液，等量分种，置于恒温培养箱中，静止期时将其随机分为3组。

2.3 制备含药血清 将30只SPF级6周龄雄性Wistar大鼠，随机分3组(正常组、模型组、木丹颗粒组)，每组10只，适应性饲养1周，木丹颗粒组用每日2.3 g/kg的给药剂量灌胃[6]，正常组和模型组大鼠用等容积生理盐水灌胃，期间各组大鼠自由喂食，连续5 d。在第5天灌胃结束1 h后，各大鼠通过腹主动脉收集血液。将各组血液以3 000 r/min离心后，取血清，在56 ℃水浴中灭活补体40 min，除菌分装后，置于-80 ℃备用。

2.4 含药血清培养细胞 细胞培养复制模型以药物作用最佳时间和最佳高糖浓度[7]，正常组以5 mmol/L葡萄糖+15%正常鼠血清培养，模型组以30 mmol/L葡萄糖+15%正常鼠血清培养，木丹颗粒组以30 mmol/L葡萄糖+15%木丹颗粒血清培养，1 d后收集细胞及上清液检测指标。

2.5 观察指标及方法

2.5.1 RT-PCR检测Nrf2及HO-1的mRNA表达水平 取出人血管内皮细胞，加入1 ml Trizol，根据说明提取总RNA，用核酸蛋白分析仪测3组各6份样品的吸光度A，完成RNA的浓度测定，用电泳观察RNA完整性。根据反转录试剂盒说明制备cDNA，备存于4 ℃温度下。接下来以2×SYBR Green QPCR Master Mix 10 μL，RNase Free H2O 3.7 μL的反应体系进行PCR扩增。反应条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，40个循环。对照荧光染料0.3 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，反转录产物cDNA 2 μL，Primer-BLAST[8]设计引物，引物序列见表1。获取的Ct值根据Pfaffl MW[9]法计算待测目的基因的相对表达量。

2.5.2 Western blot检测Nrf2及HO-1的蛋白表达水平 配置制备BCA工作液(稀释对照品A∶B为50∶1)，取3组各6个样品及各浓度标准品100 μL加入EP管中，根据说明书提取、测定蛋白浓度。将蛋白与适量上样缓冲液的混合液加热变性后进行SDS-PAGE电泳分离，转膜后封闭1 h(5%脱脂奶粉)，加一抗(1∶3 000，4 ℃，过夜)，TBST洗膜3次后加二抗(1∶5 000，室温，1 h)。孵育完成洗膜3次。以β-actin为内参照，根据ECL发光法记录曝光图片，分析条带灰度值。

2.5.3 ELISA检测VEGF含量 根据ELISA说明书操作，使用INFINITE M200型多功能酶标仪检测3组每组8孔吸光度A(450 nm波长)，作出标准曲线，计算各组VEGF含量。

3 结果

3.1 各组血管内皮细胞的Nrf2及HO-1 mRNA表达水平比较 与正常组比较，模型组Nrf2、HO-1 mRNA表达水平均显著上调(P<0.05)；与模型组比较，木丹颗粒组Nrf2及HO-1的mRNA表达水平均显著上调(P<0.05)。见表2。

表2 各组血管内皮细胞的Nrf2及HO-1 mRNA表达水平比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

3.2 各组人血管内皮细胞的Nrf2及HO-1蛋白表达水平比较 与正常组比较，模型组Nrf2及HO-1的蛋白表达水平均显著上调(P<0.05)；与模型组比较，木丹颗粒组Nrf2及HO-1蛋白表达水平均显著上调(P<0.05)。见图1、表3。

注：A.正常组；B.模型组；C.木丹颗粒组

表3 各组血管内皮细胞的Nrf2及HO-1蛋白表达水平比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

3.3 各组人血管内皮细胞上清液中VEGF含量比较 与正常组比较，模型组中VEGF含量显著增加(P<0.05)；与模型组比较，木丹颗粒组中VEGF含量显著减少(P<0.05)。见表4。

表4 各组人血管内皮细胞上清液中VEGF含量比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

4 讨论

糖尿病患者AS的发病机制尚未完全阐明，有研究表明高糖环境激活的氧化应激反应和内皮细胞功能紊乱均参与AS的发生发展[10]。血管内皮细胞受到环境刺激激活氧化应激反应时，产生的大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)可过度氧化血管壁中的低密度脂蛋白，触发凋亡程序，破坏血管壁的完整性[11]。高糖刺激也可诱导超氧化物的产生，其与内皮来源的一氧化氮相互反应产生的过氧亚硝酸盐可直接损伤血管内皮细胞的结构、形态及功能[12]。

Nrf2/ARE信号通路是调节氧化应激反应的主要信号通路[13]。Nrf2是该通路的始动激活剂[14]，ARE是人体内多种抗氧化酶均含有的一个相同启动子序列[15]。生理状态下，胞浆中Nrf2与果蝇激动蛋白结合蛋白结合，是无活性偶联状态，机体高糖环境氧化应激状态下，Nrf2磷酸化与结合蛋白分离，转位与特异的DNA-启动子结合序列ARE结合[16]，产生转录活性，激活后续基因对HO-1、γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶、超氧化物歧化酶等的表达，抑制血管内皮细胞ROS过量产生，发挥抗氧化应激的自我保护作用，阻止动脉硬化进展。Jiménezosorio等[13]研究表明，在2型糖尿病的病理状态下，Nrf2会上调，改善氧化应激，形成相应的保护机制。

HO-1是Nrf2/ARE信号途径重要的下游因子，也是体内重要的抗氧化酶，具有抗氧化、抑制细胞凋亡和调节信号转导的作用[17]。Gou等[18]发现上调db/db小鼠HO-1含量以减少氧化应激的发生，以达到改善内皮细胞功能、防治AS的作用。VEGF是重要的促血管生成因子之一[19]，直接参与内皮细胞的增殖迁徙和血管新生。AS的许多发病因素，如缺氧、高血糖及各种生长因子等均可加剧VEGF的合成并发挥作用[20]。VEGF在刺激血管内皮细胞增殖迁移的同时还能促进黏附因子和炎症的表达，激活白细胞，释放炎症因子[21]，加重氧化应激程度。有体外细胞培养证实，VEGF能促使血管内皮细胞合成细胞外基质损伤血管[22]。

AS可归属于中医学“脉痹”“头痛”“胸痹”“眩晕”等疾病的范畴，其病在血脉，属于血脉病。《医林改错》云：“元气既虚，必不能达于脉管，血管无气，必停留而瘀。”《素问·举痛论》中提出“百病生于气”。气的功能失常，推动无力则血行不畅，致血脉不畅，久而生瘀。现代中医也将血液高凝状态、血管壁受损、脂质斑块形成、血栓形成等视为血瘀证，认为血脉不通，血滞阻络易致AS。故中医学治疗AS多以益气、活血、通络为治疗基本原则。木丹颗粒是由黄芪、三七、赤芍、川芎、红花等组成的具有益气活血通络功效，用于治疗周围神经病变的上市中成药。近期研究显示木丹颗粒有减轻糖尿病患者血管慢性炎症反应、降低颈动脉内膜中层厚度、抗AS等作用，对抗氧化应激、改善血管内皮功能有良好疗效[23]。现代研究显示，三七能通过多种机制防治AS[24]。侯腾飞等[25]总结黄芪皂苷、川芎嗪、红花黄色素A能调节脂质代谢、抗氧化，赤芍总苷则可保护血管内皮细胞。本实验发现，模型组Nrf2、HO-1的表达较正常组增多，这是高糖环境下血管内皮细胞对氧化应激所做出的代偿性反应。应用木丹颗粒干预后，Nrf2、HO-1的表达水平较模型组上调，这是由于抗氧化酶受药物影响进一步活化发挥抗氧化应激作用。另外，模型组VEGF的含量明显多于正常组，药物干预后含量下降，可见高糖环境可刺激VEGF合成增多，而木丹颗粒能有效地抑制其含量的上调。

综上所述，木丹颗粒在高糖环境下能通过活化Nrf2/ARE信号通路，抑制VEGF合成，减轻氧化应激，保护血管内皮细胞，以达到抗AS的作用。