Xpert HIV-1 病毒载量检测系统用于HIV-1 病毒载量检测的临床价值

杨 坤， 王 静， 李同心， 李俊刚， 李 梅， 罗福龙， 邓仁麑， 刘 敏， 聂晓平， 陈耀凯

HIV的载量水平与HIV感染后病情发展和预后 有密切关系[1-2]，检测感染者血浆中HIV病毒载量（viral load）对于预测疾病进程、制订治疗方案、监测用药疗效和辅助诊断等[3-4]均有重要临床参考价值。实时荧光定量PCR扩增技术是目前临床广泛使用的HIV-1病毒载量检测技术之一，国内主要使用Abbott m2000或COBAS集核酸提取和核酸检测为一体的病毒载量检测系统，适合于大批量样本的检测[5-7]。Xpert HIV-1病毒载量（Xpert HIV-1 VL）检测是依托全自动GeneXpert仪器进行反转录PCR（RT-PCR）的体外测试方法，在40～1×107拷贝（cp）/mL的线性范围内检测血浆中HIV-1 RNA含量[8]。WHO在2017年7月推荐该技术作为一种HIV-1 VL体外检测手段[9-10]。本研究以Abbott m2000为标准，对比两种方法检测结果的一致性，探讨Xpert HIV-1的临床应用价值和优势。

1 材料与方法

1.1 研究对象

随机收集2017年7-11月重庆市公共卫生医疗救治中心门诊或住院患者血标本共191份，分别来自172例确诊的HIV-1感染者和19例非HIV-1感染的其他疾病患者。HIV感染或艾滋病临床诊断标准符合2015年中华医学会感染病分会艾滋病学组制定的《艾滋病诊疗指南第三版（2015版）》[11]。其他疾病诊断也符合相应诊断标准。本研究取得了重庆市公共卫生医疗救治中心伦理委员会同意。

1.2 试剂与仪器

GeneXpert Dx 系统（包括GeneXpert仪器，GeneXpert Software Version 4.6a）和HIV-1 VL检测试剂盒均购自于美国Cepheid AB公司。Abbott m2000检测系统（包括自动化样本提取仪器，型号为Abbott m2000sp ；实时荧光定量PCR扩增与检测仪器，型号为 Abbott m2000rt）、COBAS®TaqScreen MPX提取纯化试剂盒和HIV-1核酸测定试剂盒（PCR-荧光法，Abbott Molecular Inc.）均购自美国Abbott公司。COBAS检测系统（包括自动化样本提取仪器，型号为COBAS®AmpliPrep；实时荧光定量P C R 扩增与检测仪器，型号为COBAS®TaqMan 48），COBAS®AmpliPrep提取纯化试剂盒和HIV-1型核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光法） COBAS®AmpliPrep/COBAS®TaqMan®HIV-1 Test，Version 2.0均购自美国Roche公司。

1.3 标本采集和保存

采集患者静脉全血8 ～10 mL，EDTA-K2抗凝，轻轻上下颠倒混匀，3 h内以离心半径8.8 cm，1 500 r/min 离心10 min，分离血浆，收集于3支无菌的冻存管中，每支冻存管分装体积大于1.2 mL，放入-20 ℃或以下冷冻保存，1周内完成检测。检测前需对冻存样本进行常温解冻，解冻后样本肉眼观察澄清透明，可以直接用于病毒载量检测；若样本浑浊，则需低速离心（离心半径8.8 cm，1 500 r/min 离心2 min）后取上清液用于病毒载量检测。

1.4 检测方法

1.4.1 Abbott m2000 检测方法 将1 mL血浆样本加入Abbott m2000sp核酸分离纯化仪专用样本孔里，仪器自动进行核酸提取与制备。使用Abboot m2000rt PCR检测系统和配套的HIV-1型核酸测定试剂盒（PCR-荧光法）对核酸进行病毒载量检测，有效定量检测范围：40～1×107cp/ mL。

1.4.2 Xpert HIV-1 VL检测方法 按照说明书：打开Xpert HIV-1 VL检测试剂盒加样孔，取1 mL血浆样本缓慢加入样本孔里，关闭样本孔盖。打开GeneXpert仪器，运行GeneXpert Software Version 4.6a，将试剂盒扫描载入仪器检测仓内即开始病毒载量的检测，90 min后观察记录检测结果。结果解释：Xpert HIV-1 VL测定的转换因子为1 cp/mL=1.72 IU/mL，检测线性范围为40～1×107cp / mL。注意事项：每个检测试剂盒只能检测一份样本；加样过程不能产生气泡；加样后的试剂盒不能颠倒，且需4 h内上机检测。质量控制：每个检测试剂盒含有样本容量充分性控制（SVA）、内部定量标准高和低（IQS-H和IQS-L），及采样处理控制（SPC）和探针检查控制（PCC）对检测全程进行内部质量控制。

1.4.3 COBAS检测方法 对Abbott m2000和Xpert HIV-1 VL检测结果不一致的血浆样本重复检测；对复检结果不一致的样本，采用COBAS进行检测。COBAS检测方法大致步骤：将1 mL血浆样本加入COBAS®AmpliPrep核酸分离纯化仪专用样本孔里，仪器自动进行核酸提取与制备。使用COBAS®TaqMan 48 PCR检测系统和配套的HIV-1型核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光法） COBAS®AmpliPrep/COBAS®TaqMan®HIV-1 Test，Version 2.0对核酸进行病毒载量检测，检测线性范围为20～1×107cp/mL。

1.5 统计学分析

采用统计软件SPSS 18.0进行数据处理，并用数据对数级进行绘图和比较分析。定性结果分析使用Kappa值来判断Xpert HIV-1 VL和对照方法检测结果的一致性。定量结果分析使用一元线性回归和Bland-Altman模型评价Xpert HIV-1 VL与对照方法定量检测结果的一致性，检验水准α=0.05。Bland-Altman模型偏倚用两试剂测定结果差值的均数和标准差SD描述，95%的一致性界限（LOA）位于-1.96SD和+1.96SD之间。

2 结果

2.1 一般资料

191份样本来自145例男性和46例女性患者，年龄范围11～94岁，平均（46.0±16.7）岁；其中172例临床诊断为HIV-1感染或艾滋病（包括1例艾滋病合并丙型肝炎病毒感染者），19例为非HIV-1感染者（8例肺结核患者、1例高血压患者、1例支气管扩张合并细菌感染患者和9例乙型肝炎病毒感染者）。

2.2 Xpert HIV-1 VL检测结果

Xpert HIV-1 VL检测191例患者病毒载量数值分布情况见图1，以样本病毒载量拷贝数的对数（log10）为横坐标，以样本例数的频数为纵坐标。每个检测范围都有一定数量的样本量，病毒载量检测结果≥40 cp/mL的样本例数168例，占总样本的88.0%。1例艾滋病和19例非HIV-1感染者的血浆样本Xpert HIV-1 VL检测结果均为“阴性”。

图1 191 例Xpert HIV-1 VL 检测值的频数分布Figure 1 Frequency distribution of HIV-1viral load detected by Xpert HIV-1 VL system in 191 cases

2.3 两种检测结果的一致性分析

对191份血浆样本使用Xpert HIV-1 VL和Abbott m2000进行HIV-1 RNA检测的结果分析，见表1。1例艾滋病Xpert HIV-1 VL检测结果为“阴性”，171例HIV-1感染血浆样本检测结果为“阳性”，与Abbott m2000检测结果相同。19例非HIV-1感染者的血浆样本Xpert HIV-1 VL检测结果均为“阴性”，也与Abbott m2000检测结果一致。两种检测结果阳性符合率、阴性符合率和总符合率均为100%， Kappa 值为 1.00。

表1 Xpert HIV-1 VL 和Abbott m2000 HIV-1 RNA 检测结果的一致性分析Table 1 Consistency analysis of HIV-1 RNA detection results via Xpert HIV-1 VL and Abbott m2000（n）

2.4 两种方法含量检测结果的相关性分析

1 9 1 份样本含量检测见表2。其中2 8 份样本由于Xpert HIV-1 VL和Abbott m2000检测结果小于检测下限（40 cp/mL）或大于检测上限（107cp / mL），这些样本的检测结果无法作为连续型变量纳入到定量分析。

表2 Xpert HIV-1 VL 和Abbott m2000 检测结果分布Table 2 Distribution of the results by Xpert HIV-1 VL and Abbott m2000[n（%）]

以Abbott m2000的定量检测结果的对数（log10）为x轴，Xpert HIV-1 VL的定量检测结果的对数（log10）为y轴做散点图（图2）。建立回归方程y= 1.025 1x+ 0.405 3。对回归方程进行F检验，结果显示F值为1 768.85，P＜0.001，方程差异在统计学上具有显著意义。 线性回归方程截距为0.405 3，95%CI（0.197 9～0.612 7），对截距进行t检验，结果显示t值为3.845 1，P＜0.001，截距在统计学上具有显著意义。线性回归方程斜率为1.025 1，95%CI（0.976 9～1.073 3），对斜率进行t检验，结果显示t值为42.057 7，P＜0.001，斜率在统计学上具有显著意义。

172份样本，用Xpert HIV-1 VL和Abbott m2000测量结果对数值（log10）的平均值为横轴，两种试剂测量结果对数值（log10）的差值为纵轴做Bland-Altman 散点图，结果分析见图 3。LOA（x±1.96SD）为 -1.180 5～0.160 2；95.3%（164/172）的样本位于LOA范围内，4.7%（8/172）的样本位于LOA范围外。Xpert HIV-1 VL检测结果的对数值与Abbott m2000检测结果的对数值的线性相关系数为0.957 6，95%CI（0.942 6～0.968 8）。

图2 两种方法的线性回归相关性分析Figure 2 Linear regression correlation analysis of the two HIV-1 viral load assays

图3 两种方法的Bland-Altman 分析Figure 3 Bland-Altman analysis of the two HIV-1 viral load assays

2.5 两种方法对于不同基因型HIV-1的检测效果分 析

纳入统计分析的191份样本中有47例患者样本有HIV-1的基因分型结果，BC重组型45例，B/B’型2例，并且这47例的样本Xpert HIV-1 VL和Abbott m2000检测结果均为阳性。

3 讨论

基于核酸检测的实时荧光定量PCR是高通量HIV-1病毒载量检测的首选方案[12]。然而，这些检测中样品制备复杂、仪器和操作人员及实验室等要求高，检测成本高、时间长。最近WHO指南建议用床旁检测（point of care testing， POCT）代替核酸检测[13]。Xpert HIV-1 VL是一种借助全自动仪器 GeneXpert进行RT-PCR反应的体外诊断方法，用于快速定量来自HIV感染者/AIDS血浆中的HIV-1 RNA含量，满足POCT的要求。Xpert HIV-1 VL采用实时定量RT-PCR技术以达到高灵敏度，针对HIV-1群M亚型A、B、C、D、AE、F、G、H、AB、AG、J和K以及N、O等亚型，定量检测最低限度为40 cp/mL，线性范围为40～1×107cp / mL。每个测试在一个完全集成的封闭盒里完成，并在90 min内提供结果[8]。

Xpert HIV-1 VL检测系统、临床使用较广泛的COBAS检测系统[5-7]和Abbott m2000检测系统[5-6]均采用实时荧光定量PCR扩增技术检测HIV-1 RNA含量，而且样本的核酸提取方法的原理近乎相同，因此本研究采用Abbott m2000为对照，两种方法检测不一致时通过COBAS进行验证，此研究方法与国外已发表的文献[8，14-16]一致。本研究结果两种方法阳性符合率、阴性符合率和总符合率均为100%， Kappa 值为1.00，说明Xpert HIV-1 VL和Abbott m2000 HIV-1 RNA检测结果高度一致。两者线性回归方程为：y= 1.025 1x+ 0.405 3，r=0.957 6，95%CI（0.942 6～0.968 8），以上结果显示在临床应用中Xpert HIV VL具有良好的灵敏度、准确性和稳定性，对于血浆样本中HIV RNA的检测能力与Abbott m2000具有较好的临床等效性，可用于定量检测。有研究分别报道来自不同实验室采用Xpert HIV-1 VL与Abbott m2000（或COBAS）的对比研究，两种方法的相关系数范围为0.81～0.99[17-20]，荟萃分析显示Pearson和Spearman相关系数分别为0.94（95%CI：0.89，0.97）和0.96（95%CI：0.86～0.99）[11]，表明Xpert HIV-1 VL与参考方法病毒载量值之间非常高的一致性。

191份样本中有9份干扰样本取自病毒性肝炎患者，Xpert HIV-1 VL和Abbott m2000检测结果均为阴性，说明乙型肝炎病毒不会影响Xpert HIV-1 VL对HIV-1病毒的检测结果。47份有基因型的样本（BC重组型和B/B’型）Xpert HIV-1 VL和Abbott m2000的检测结果相同，均为阳性，表明考核试剂盒对HIV-1中不同基因型有很好的检测能力。

Xpert HIV-1 VL检测与WHO认可的用于结核病诊断的Xpert MTB/RIF具有相同的GeneXpert运行平台。Xpert MTB/RIF系统用于检测结核分枝杆菌和利福平耐药性，全世界使用该系统超过2 300万[21-22]。结核病和艾滋病在发病人群、防治模式等方面具有一定的相似之处[23]，如果能整合两者资源，在结核病和艾滋病双向筛查、检测等工作中，利用现有的GeneXpert平台进行HIV病毒载量检测可大大增加HIV-1 VL检测的可行性。

总之，本研究证实Xpert HIV-1 VL用于检测HIV-1 RNA具有很高的灵敏度、准确性和稳定性，同时具有操作简单、方便、安全、快捷等优势，对操作场地和人员无需特殊要求，适合临床应 用。