酶联免疫吸附试验及注意事项

张晓亭，宋琳琳，秦百众

（1.许昌市建安区动物疫病预防控制中心 461000；2.平舆县农业农村局 463400）

免疫抗体检测作为评估重大动物疫病疫苗免疫评估效果最直接的手段，对于养殖业来说具有很重要的意义。 而传统的抗体检测方法如针对禽流感、新城疫的血凝与血凝抑制试验，针对布鲁氏菌病的虎红与试管凝集试验，费时费力，且容易出现假阳性假阴性的结果，随着检测技术的不断进步，ELISA 凭借其特异性好、 灵敏度高等优点逐渐成为动物疫病防控中疫苗免疫抗体检测的主力军。

1 基本原理

将已知的抗原或抗体结合于固相载体表面，并保持抗原或抗体的免疫活性。 将抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，同时保持酶的活性与抗原或抗体的免疫活性。 在检测时，将待检血清样品与酶标抗原或抗体按不同的步骤加入反应板，使之与固相载体表面的抗原或抗体反应结合，洗涤去除其他杂质，则最后结合在固相载体表面上的酶量与待检血清样品中的抗原或抗体量呈一定的比例。 加入底物，其所含的供氢体可在酶的作用下被还原为有色的氧化型，出现颜色反应。 故可通过颜色的深浅判断待检血清样品中抗原或抗体的量。

2 分类

2.1 间接ELISA

间接ELISA 是将特异性抗原包被于固相载体表面，形成固相抗原，若待检血清样品中存在抗体则与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物，洗涤去掉血清中的杂质与其他免疫球蛋白，只留下固相抗原抗体复合物，加入酶标抗体，与固相抗原抗体复合物中的抗体结合，洗涤去掉未反应的酶标抗体，洗涤后的固相载体上的酶量就代表待检血清样品中抗体的量。 加入底物与酶结合显色，颜色深代表待检血清样品中抗体量多；颜色浅代表待检血清样品中抗体量少。

2.2 竞争或阻断ELISA

竞争或阻断ELISA 是将特异性抗原包被于固相载体表面，形成固相抗原，待检血清样品中存在抗体则与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物， 再加入酶标抗体与之竞争结合特异性抗原，（或者是用酶标抗体阻断特异性抗原与待检血清样品中抗体相结合），加入底物与酶结合显色，颜色深代表酶标抗体结合的抗原量多而待检血清样品中的抗体结合的抗原量少， 即待检血清中的抗体量少； 反之颜色浅代表酶标抗体结合的抗原量少而待检血清样品中的抗体结合的抗原量多， 即待检血清中的抗体量多。

3 实验操作注意事项

3.1 实验前注意事项

3.1.1 移液器定期检定、校准，确保加样的准确性；酶标仪定期校正检查滤光片，确保读值的准确性；实验前要检查确保洗板机的每个针孔畅通无堵塞。

3.1.2 试剂盒中所有试剂包括反应板、血清样品在使用之前应平衡至室温（20℃～25℃）.

3.1.3 冷冻样品使用前应混匀。

3.1.4 不同批次试剂盒的反应板、对照及酶标抗体等可能存在差异，故不能混用。

3.1.5 不用过期试剂盒，以免影响实验结果。

3.2 实验中注意事项

3.2.1 根据试剂盒的要求对血清样品进行稀释，注意稀释倍数，注意阴阳对照需要稀释与否，注意每种试剂的加样量，加样时注意要悬空加样，做到不贴底，不贴壁。

3.2.2 注意实验的孵育温度，室温孵育时要控制室内温度在20℃～25℃，且要避免在冷气、阳光直射、热源或通风口等温度不均匀的地方实验，且不能把反应板直接放在冰冷的实验桌面。 当室温较低时，建议在25℃恒温箱内进行实验的孵育步骤。

3.2.3 洗板过程中要避免漏液、溢液现象，若同时做两个及以上实验，注意在洗板前更换洗液，洗板后要更换吸水纸轻轻拍干。

3.2.4 所有试剂一经倒出，切忌不可再倒回试剂瓶内，以防污染。

3.2.5 加入底物后应立即避光显色，若实验需要两种底物混合使用，则需现用现配。