CHO细胞中通过基因过表达提高治疗性蛋白产量的策略

周 琴，韩倩倩，张兰兰 ，吴朋飞，马冰冰，马腾飞，徐昌志，张部昌

(1. 安徽大学 物质科学与信息技术研究院，合肥 230601; 2. 安徽天祥粮油食品有限公司，阜阳 236300)

治疗性蛋白在病毒感染、自身免疫疾病、临床恶性肿瘤等治疗方面取得了显著疗效，其中抗体药物占比居多。自从1986年第一个治疗性抗体进入临床以来，抗体药物行业得到了迅猛发展。截至2017年上半年，全球抗体药物市场规模已达到490亿美元，国外市场容量快速攀升，同时国内抗体药物市场规模也在逐年递增[1]。用于重组蛋白生产的哺乳动物细胞包括人胚胎肾细胞HEK293、人胚胎视网膜细胞PERC6、非洲绿猴肾细胞COS-7、小鼠骨髓瘤细胞NSO和SP2/0和CHO细胞等。其中，近70%的重组蛋白药物是由CHO细胞生产的[2]，这主要得益于以下几点：1)具有与人相似的翻译后修饰功能；2)FDA监管机构的认可以及清晰的历史背景；3)内源性蛋白分泌极少；4)很容易在化学定义的无血清培养基中适应高密度悬浮生长；5)比其他哺乳动物细胞系更不容易感染病毒；6)利用二氢叶酸还原酶(Dihydrofolate reductase, DHFR)和谷氨酰氨合成酶(Glutamine synthetase, GS)基因扩增系统来进行筛选，有利于外源基因的表达。该细胞可塑性好，易于改造并能高效表达外源蛋白，已用于生长激素、促红细胞生成素、组织活化遗传因子、凝血因子等生物蛋白的生产。

如今，CHO细胞已成为重组蛋白制造业的首选宿主。CHO细胞工厂稳定性的改善仍是满足日益增长的治疗性蛋白质需求的关键挑战，在重组蛋白的生产过程中还有许多限速步骤仍有待解决，需要开发和采用新的策略来实现高效的哺乳动物细胞生产过程。通过传统方法优化培养工艺和培养基，可提高细胞增殖或最大可存活细胞密度(Viable cell density，VCD)[3]。此外，通过基因工程方法提高CHO工程细胞株的性能也经过大量的细胞工程实验得以实现并成功应用[4]。这些方法包含了过表达有利基因通过敲除或siRNA/shRNA介导的敲低作用对不利基因产物进行抑制等方法。其中过表达技术操作简单易行，副作用较低，是一种高效的基因工程改造手段。该方法的基本步骤包括：1)将有益的功能基因稳定地整合到基因组上；2)从多克隆池里分出单克隆细胞，从而获得表达高而稳定的工程细胞。

1 控制细胞的增殖和死亡

1.1 过表达促进增殖相关基因

在生物加工过程中，细胞特异性的生产力降低通常与细胞增殖加快导致的生长周期缩短有关。生产阶段的延长促进了细胞生物量的快速累积，而生产阶段的特点是细胞特异性生产力的提高。结合这个理论，Doolan等[5]比较了生长快慢不同的两种CHO工程细胞株，采用基因芯片和蛋白质组学分析得出含缬酪肽蛋白(Valosin-containing protein, VCP)对CHO细胞生长和存活率具有重大影响，过表达VCP最终使得细胞的存活密度提高了20%～30%。Lin等[6]通过过表达丝氨酸蛋白酶抑制剂家族成员Serpinb1，VCD和IgG单位体积产量分别提高了1.3倍和2.0倍。Darrin和Mohamed[7]在CHO细胞中过表达促细胞分裂癌基因c-myc，结果在没有额外的营养供给条件下将VCD提高了近70%。Mahameed和Tirosh[8]结合定向进化的理论，证明过表达突变型酪氨酸激酶受体KIT(D816V)能够赋予细胞高度的增殖能力和对激酶抑制剂的抵抗能力。工业生产常常受到培养后期细胞增殖太快和营养限制的约束，因此采用流加培养的工艺会延长细胞的生长周期，但是由此带来的成本很高。通过过表达促进增殖相关基因使细胞在较短时间内达到最大活细胞密度从而提高产量不失为一种高效低成本的手段。

1.2 过表达抗凋亡相关基因

克服凋亡来提高细胞生产能力是有效生产治疗蛋白广泛应用的策略之一[9]。通过建立过表达抗凋亡基因的稳定细胞系，使细胞对环境胁迫的耐受性增强，可以提高重组蛋白的产量[10]。Zhang等[11]发现在转染抗凋亡基因Bcl-x的CHO细胞中，抗PD1抗体的总产量增加约82%，在转染抗凋亡基因Mcl-1的CHO细胞中，抗体总产量增加34%。Sauerwald 等[12]证明过表达X-连锁凋亡抑制剂(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)可促进CHO细胞生长和延长培养寿命，同时可提高生产力。Majors等[13]通过表达一种突变的Bcl-XL基因，可以提高CHO细胞的抗凋亡能力。研究人员还利用其他抗凋亡基因如B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、凋亡抑制基因Aven、Fas凋亡途径抑制分子(Fas apoptotic inhibitory molecule, FAIM)等来抑制凋亡[14]。最新报道指出，在促凋亡条件下，外泌体增强了细胞的活性。由于外泌体来源于CHO细胞本身，因此抑制细胞凋亡不仅有利于提高CHO细胞培养的生产力，还能减少安全顾虑[15]。综上，为了使细胞适应工业化长期大规模培养，过表达抗凋亡基因能够有效提高细胞的抗凋亡能力，进而提高重组蛋白的产量，但是与此带来的细胞株筛选困难也会随之增加。

1.3 过表达自噬相关基因

自噬能使哺乳动物细胞通过自身细胞器和其他细胞成分降解而产生能量，在生产过程中，饥饿条件也会诱导CHO细胞自噬[16]。CHO细胞工程可以同时靶向自噬和凋亡途径，已经有报道过表达AKT、Bcl-XL或者共表达Bcl-2和Beclin1来减缓自噬，延长培养寿命[17-19]。然而，仅仅通过过表达自噬通路基因ATG9A的方法来单纯调节自噬的策略无法影响自噬，因此这些手段并没有增加CHO细胞中的治疗性蛋白产量[20]。充分了解其分子基础，还有待深入研究，并最终有助于发现适合利用细胞工程改造的自噬相关基因。

1.4 过表达阻滞细胞周期相关基因

将细胞周期阻滞在G1期能够带来普遍产量提高的功效[21]。细胞周期阻滞与细胞周期素依赖性激酶抑制剂、细胞周期素依赖性激酶以及细胞周期素有关[22]。基于这一点，Pratik等[23]证明共过表达细胞周期依赖性激酶3(Cyclin-dependent kinases 3, CDK3)和细胞色素c氧化酶第15亚基(Cytochrome oxidase 15, COX15)可增加活细胞密度。Meents等[24]将p27KIP1和p21CIP1瞬时转染进生产分泌型碱性磷酸酶(Secreted alkaline phosphatase, SEAP)的工程CHO细胞中实现了产量的提高。Carvalhal等[25]研究证明p21CIP1过表达可以抑制细胞周期和生长，提高生产力，同时增加线粒体和核糖体的细胞体积和生物发生量。Lee等[26]通过过表达野生型和突变型CHO细胞周期调控因子(Cell division cycle 25A, CDC25A)，发现突变的CDC25A过表达克隆表现比野生型高约20%的比生产率。过表达阻滞细胞周期的基因显著抑制了细胞的生长，加大了细胞株筛选工作的困难，但是能显著提高产量，这可能与代谢消耗的增加伴随着氧气、谷氨酰胺、葡萄糖和胞内AMP/ADP/ATP的消耗有关。

2 控制细胞的代谢和分泌

2.1 过表达提高代谢相关基因

CHO细胞培养过程中氨和乳酸的积累对细胞生长和产品质量有不利的影响。调控参与细胞代谢基因的表达是提高CHO生产细胞性能的重要手段。为了减少谷氨酰胺产生的氨，Zhang等[27]构建了一种重组CHO细胞表达谷氨酰胺合成酶来催化谷氨酸和氨生成谷氨酰胺，使得重组蛋白产量提高了18%。乳酸是哺乳动物细胞培养中重要的代谢产物之一，高乳酸水平是由高氧糖酵解引起的，也称为沃伯格效应，并通常与不良的培养性能有关，因此，为提高生长、生产力和加工稳健性，减少乳酸的积累已成为细胞培养发展中的一个持续挑战[28]。改变与丙酮酸代谢途径有关的几种遗传调控策略也多次被报道，Chong等[29]在代谢学的研究中证明了过表达苹果酸脱氢酶Ⅱ(Malate dehydrogenase, MDHⅡ)使得整体存活细胞数提高了1.9倍。Tabuchi等[30-31]发现过表达牛磺酸转运蛋白或者共表达牛磺酸转运蛋白和丙氨酸转氨酶均能将CHO细胞的产抗能力提高到47%以上。因此，过表达代谢相关基因可以有效提高细胞面对代谢废物等的抗压能力，从而提高产量。

2.2 过表达促进分泌相关基因

在CHO工程细胞中稳定插入基因来增强细胞蛋白的生物合成量或者分泌功能可以显著提高治疗性蛋白的产量。例如过表达转录因子4(Activating transcription factor 4，ATF4)、DNA损害可诱导蛋白34(Growth arrest and DNA damage inducible gene 34, GADD34)可以将重组人抗凝血酶III(Antithrombin III, AT-III)的产量提高1.4～2倍[32-33]。在一个稳定表达单克隆抗体的CHO细胞中，过表达转录因子YY1也能将产量提高6倍[34]。这种正效应导致的产量提高被证明是转录后的翻译修饰及分泌功能加强所引起的。随着一些复杂、难表达的治疗性蛋白的需求量增加，一些策略也已经慢慢开始被开发出来，为临床研究和市场供应提供一些素材。Pybus等[35]报道了共表达免疫球蛋白结合蛋白(Immunoglobulin binding protein, BIP)、激活转录因子6C(Activating transcription factor 6C, ATF6C)和X-Box结合蛋白1(X-Box binding protein 1, XBP1)可以提高CHO细胞对一些难表达抗体的表达能力。Le等[36]还发现了一个策略来克服难表达治疗性蛋白的局限性，他们通过过表达人信号受体蛋白14(Signal receptor protein 14, SRP14)来提高细胞的分泌能力。科学家们进一步利用基因编辑技术来探索靶向分泌途径的各种不同基因，从而提高治疗性蛋白的分泌。例如过表达蛋白二硫化物异构酶(Protein disulfide isomerase, PDI)[37]、神经酰胺转运蛋白(Ceramide transfer protein, CERT)[38]、突触小体相关蛋白23(Synaptosomes-associated protein of 23 ku, SNAP-23)[39]等都被证明可以提高治疗性蛋白的产量。因此，过表达促进分泌相关的基因能够显著提高一些难表达蛋白的产量。

3 控制细胞内转录后翻译

针对某一个基因进行编辑存在一定的局限性，也有一些研究同时过表达两个基因[11, 17]，但同时过表达两个，甚至超过两个基因时会过多占用细胞翻译资源，从而限制了重组蛋白产量的进一步提高。筛选并应用具有多种功能的潜在分子成为一种研究方向。同时，近些年小分子RNA的研究成为热点[40-42]。因为小分子RNA不占用细胞的转录翻译资源，不会给内质网过度施加压力，并且能够靶向多个基因，达到同时编辑多个效应基因的效果，成为一种高效的基因工程手段。例如过表达miRNA-17、miRNA-2861、miRNA-1287、miRNA-483等均能够有效提高重组蛋白的产量[43-46]；过表达miRNA-557可以使难表达蛋白的效价提高两倍以上[47]；过表达整个miR-30家族均能增强CHO细胞中的重组蛋白生产[48]；过表达miRNA-143靶向有丝分裂原激活蛋白激酶7(Mitogen-activated protein kinase, MAPK7) 来显著提高蛋白产量，而不会对重组CHO细胞的生长和存活率产生负面影响[49]。与此同时，该方法也存在一定缺陷，正因为小分子RNA的靶点多，副作用不明确，因此关于过表达miRNA方向的研究还有待进一步挖掘。

4 控制细胞对抗体的糖基化修饰

虽然由CHO细胞产生的治疗性重组蛋白通常被认为是安全的，可以用于人类疾病治疗，但是人们认为其表现出的与人类类似但并不相同的翻译后修饰还不足够充分[50]，因此在CHO细胞中已经采用不同的基因工程方法来修饰生产出来的重组蛋白的糖基化模式[51]。和人源、鼠源细胞相比，CHO不能表达半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶(Beta-galactoside alpha-2,6-sialyltransferase, α-2,6(ST6GAL))，只能表达半乳糖苷唾液酸转移酶(Beta-galactoside alpha-2,3-sialyltransferase, α-2,3(ST3GAL))，因此CHO细胞本身就不能产生具有相似末端唾液酸含量的糖蛋白[52]。Fukuta等[53]通过过表达N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶Ⅲ(N- acetylglucosaminyltransferase III, GnTⅢ)证明改善GLCNAC残基的糖链比例对治疗有积极作用。Jassal等[54]证明在CHO细胞中过表达不同物种(人类、仓鼠、小鼠)的ST6GAL可以增强重组蛋白N端唾液酸糖基化修饰。

5 结语

近20年来，基因工程已成为CHO细胞生物学中一门强大而多功能的学科。迄今为止，在最大存活细胞密度和产量方面的非凡进展，很大一部分归功于基因过表达策略在CHO细胞工程中的应用。以上对过表达不同的基因进行了概述，其中过表达促进增殖相关基因能够在快速培养模式下，以最短时间达到最大VCD从而实现重组蛋白的快速生产；而过表达抗凋亡基因在工业大规模持续培养的模式下是提高产量最普遍、最常用的一种策略，但是也存在一定缺陷，例如细胞的增殖缓慢，细胞株的筛选周期较长；过表达与自噬相关基因也能提高重组蛋白的产量，但是自噬不是最主要的死亡形式，因此其应用存在一定局限性；过表达阻滞细胞周期相关基因对产量的影响目前存在争议，表现为明显的生长抑制，与此同时增加了单克隆细胞株筛选的难度；对于一些难表达的治疗性蛋白，过表达与代谢和分泌相关的基因可以明显提高其产量；过表达与糖基化修饰相关的基因是提高完整型IgG形式的一个途径。为实现同时改变细胞的多种功能，同时过表达多个基因也能够改善细胞性能从而提高产量，但是会引入过多的抗性基因，占用细胞内翻译资源。因此，筛选具有多种功能的单个基因成为研究的热点。新的研究方向主要为两方面：1)以肿瘤进化过程中产生的定向突变基因作为靶点；2)近年来大量研究发现非编码RNA在CHO细胞中发挥显著作用，miRNA工程以及其他非编码RNA如circRNA、link RNA、 lncRNA等还有很大的探索空间，未来将进一步拓展CHO细胞工程涉及的过表达基因的靶点范围。