胃癌组织中miR-106b、BTG3的表达变化及意义

杨俭，薛辉，穆素恩，艾蓉，范红伟

石家庄市第一医院，石家庄050031

胃癌是起源于胃黏膜上皮的消化系统恶性肿瘤，具有进展快、恶性程度高及预后差等特点，严重威胁人们生命安全。据循证医学统计，我国是胃癌高发国家，每年新发和死亡的胃癌患者数量均占世界的40%[1]。由于胃癌早期诊断困难，多数患者确诊时已进展到中晚期。尽管手术或放化疗等治疗方式可以适当延长胃癌患者生命，但其预后仍较差且5年存活率不足10%[2]。微小RNA(miRNA)是真核生物中普遍存在的小分子单链RNA，其长度约为22个核苷酸，具有非编码性和高度保守性，能够调节mRNA的降解并抑制转录后翻译水平[3]。miR-106b位于染色体7q22.1，参与调控细胞周期、DNA复制以及细胞凋亡等过程[4]。既往研究表明，miR-106b在胃癌组织中异常表达，能够促进癌细胞增殖、侵袭以及迁移，但其在胃癌组织中的具体作用机制少见报道[5]。B细胞转位基因3(BTG3)是一种抑癌基因，属于酪氨酸激酶受体2(ErbB2)基因传导体家族，对调节细胞分化、细胞周期及抑制癌细胞无限增殖等具有重要作用[6]。当细胞内DNA发生损伤或受生长因子刺激时BTG3表达明显上调，且在G1/S过渡期达最高峰，从而抑制细胞不断增殖[7]。本研究探讨胃癌组织中miR-106b、BTG3的表达变化，并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 回顾性分析2017年3月～2019年3月本院收治的103例胃癌患者临床资料，男57例、女46例，年龄43～69(55.26±4.34)岁，肿瘤直径≤5 cm 58例、>5 cm 45例，有淋巴结转移21例、无淋巴结转移82例，高分化52例、中分化39例、低分化12例、有脉管癌栓27例、无脉管癌栓76例，TNM分期Ⅰ期35例、Ⅱ期43例、Ⅲ期19例、Ⅳ期6例。纳入标准：均符合《胃癌诊断标准》[8]中相关诊断标准，且经术后病理检查证实为胃癌；临床病理资料完整，且愿意配合研究；均首次诊断为胃癌，且胃部无既往手术史或放化疗史。排除标准：直肠癌、肝癌及胰腺癌等恶性肿瘤；胃穿孔、胃间质瘤及胃淋巴瘤等胃部疾病；先天免疫功能缺陷或其他遗传性疾病；严重肝肾功能障碍。本研究经医院医学伦理委员会审核通过，且患者均签署知情同意书。

1.2 胃癌组织及其癌旁正常组织中miR-106b、BTG3 mRNA表达检测 于术中采集胃癌组织及其癌旁(距肿瘤边缘>5 cm)正常组织，均用液氮保存，术后统一放入-80 ℃冰箱中保存。采用实时荧光定量PCR技术。各取组织60 mg，分别加入TRIzol试剂(购自美国Invitrogen公司)1 mL提取总RNA。应用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit试剂盒，将15 μg总RNA反转录为cDNA。反应条件均为16 ℃ 30 min、42 ℃ 30 min、85 ℃ 5 min。选用TaKaRa公司生产的SYBR Premix Ex Taq 试剂盒定量检测miR-106b、BTG3的表达。miR-106b的上游引物序列为5′-TGCGGCAACACCAGTCGATGG-3′、下游引物序列为5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′，内参基因U6的上游引物序列为5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′、下游引物序列为5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′；BTG3的上游引物序列为5′-TGTGCTGTCGGTATGGAGAG-3′、下游引物序列为5′-TCTGGTACACAGGACTTGCG-3′，内参基因GAPDH的上游引物序列为5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′、下游引物序列为5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性5 s、60 ℃退火及延伸30 s共45个循环。以上引物均由上海生工公司合成生产，且每个样本均检测3次。使用U6和GAPDH作为内参基因，应用相对Ct值法评估不同样品的 Ct值，miR-106b和BTG3的表达量相对于GAPDH和U6的比值为2-ΔΔCt，其中 Ct=C目的基因-Ct内参基因。

2 结果

2.1 胃癌组织及其癌旁正常组织中miR-106b、BTG3 mRNA表达比较 胃癌组织及癌旁正常组织中miR-106b相对表达量分别为4.56±1.02、1.26±0.32，BTG3 mRNA相对表达量分别为0.57±0.14、1.21±0.37。胃癌组织中miR-106b相对表达量较癌旁正常组织高(t=31.329，P=0.000)，BTG3相对表达量较癌旁正常组织低(t=16.419，P=0.000)。

2.2 胃癌组织中miR-106b、BTG3 mRNA表达与患者临床病理特征的关系 胃癌组织中miR-106b的表达与胃癌淋巴结转移、脉管癌栓、TNM分期有关(P均<0.05)，而与患者性别、年龄及肿瘤大小、分化程度无关(P均>0.05)。胃癌组织中BTG3 mRNA表达与脉管癌栓、TNM分期有关(P均<0.05)，而与患者性别、年龄及肿瘤大小、淋巴结转移、分化程度无关(P均>0.05)，见表1。

表1 胃癌组织中miR-106b、BTG3 mRNA表达与患者临床病理特征的关系

2.3 胃癌组织中miR-106b与BTG3 mRNA表达的相关性 胃癌组织中miR-106b表达与BTG3表达呈负相关(r=-0.681，P=0.003)。

3 讨论

据流行病学调查统计，我国胃癌的发病率和病死率均位居世界前列，且呈逐年增长趋势[9]。除饮食习惯、地域差异以及感染等因素外，表观遗传和多基因遗传是导致胃癌发生和进展的重要因素[10]。目前，临床多采用手术联合化疗为主的综合治疗模式，其中化疗主要包括术前新辅助化疗和联合靶向药物治疗，但是多项前瞻性临床试验的结果表明其疗效仍较差[11]。近年来，日趋成熟的基因测序技术帮助人们深入认识基因在疾病中的重要作用，miRNA、ErbB2以及长链非编码RNA等的功能颠覆了人们的既往认知。多项研究均表明，这些基因能够调控细胞增殖、分化和凋亡且改变细胞周期;同时，这些基因的异常表达能够导致癌症易感性增加[12,13]。

miRNA属于非编码RNA，可调节mRNA的稳定性和翻译效率，并且能够降解mRNA，在遗传信息表达过程中起重要调控作用[14]。miR-106b-25基因簇位于染色体7q22 Mcm7基因内含子13上，包括miR-106b、miR-25及miR-93三种基因，其中miR-106b在肺癌等多种恶性肿瘤中过度表达，参与各种癌细胞增殖、侵袭以及转移等过程[4]。本研究结果表明，胃癌组织中miR-106b的表达较癌旁正常组织升高。分析原因，可能由于癌组织中转录因子E2F1表达上调，进而诱导微小染色体维持蛋白7过度表达，激活原癌基因，最终直接促进胃癌细胞中miR-106b表达提高[15,16]。本研究显示，胃癌组织中miR-106b的表达与淋巴结转移、TNM分期以及脉管癌栓有关，表明miR-106b不仅能够促进胃癌进展，而且可以反映胃癌的转移情况，对评估患者病情具有重要意义。其机制可能为miR-106b能够使Myc基因/转录因子E2F1/转化生长因子β信号网络发生功能紊乱，抑制激酶抑制剂p21和促凋亡因子Bim，改变癌细胞的细胞周期且不断累积受损DNA，最终促进肿瘤的分化、浸润以及转移[17]。

BTG3属于B细胞迁移基因/ErbB2转录因子家族(BTG/Tob)，其N端通过结合E2F1蛋白，阻碍DP1和E2F1转录因子结合DNA，进而使DNA合成受阻[7]。此外，BTG3能够诱导Smad8蛋白和Smad4蛋白相互结合并进入细胞核，进而参与调控细胞增殖和凋亡。据相关研究报道，BTG3蛋白的C端由于富含脯氨酸的结构域，能够结合Src蛋白，降低Src酪氨酸激酶活性，导致Ras/MAP激酶信号传导通路受阻，最终抑制细胞增殖、参与DNA损伤修复以及调节细胞周期[18]。本研究结果表明，胃癌组织中BTG3的表达量较癌旁正常组织低，其原因可能为癌细胞能够分泌特异蛋白酶降解BTG3蛋白，同时，癌组织中BTG3自身启动子甲基化导致其表达下调[19]。本研究结果表明，胃癌组织中BTG3表达与TNM分期和脉管癌栓有关，说明BTG3可以参与胃癌发生发展。其机制可能为BTG3能够阻碍血浆蛋白酶原激活抑制剂1和基质金属蛋白酶2的表达，进而抑制肿瘤血管形成、细胞增殖以及侵袭。同时，BTG3能够抑制E2F1表达，进而细胞有丝分裂和分化，而癌组织中BTG3表达下调，使其负性调控作用减弱，促进肿瘤细胞增殖及进展[20]。

本研究结果表明，胃癌组织中miR-106b的表达与BTG3的表达呈负相关。表明miR-106b和BTG3可能均在胃癌形成及进展中发挥重要作用，且miR-106b可能负性调控BTG3，进而影响胃癌进程。既往研究[21]表明，非小细胞癌中miR-106b通过抑制BTG3表达促进肿瘤细胞侵袭及转移。此外通过miR-106b抑制剂抑制其表达后，BTG3的表达量明显提高，间接表明miR-106b对BTG3的负性调控作用。然而miR-106b的靶基因众多，BTG3在胃癌组织中是否为miR-106b的靶点尚不明确，其具体机制有待于进一步深入探究。

综上所述，胃癌组织中miR-106b表达上调，而BTG3表达下调，二者均与肿瘤TNM分期和脉管癌栓有关，可能成为靶向药物作用的新靶点。