黑木耳黑枸杞复合饮料研制及其体外抗氧化性

秦丹丹，曹慧馨，白洋，赵爽，吴琼

（长春大学食品科学与工程学院，吉林长春130022）

黑木耳（Auricularia auricular）是我国传统的食药兼用菌，营养丰富，含有多糖、蛋白质、维生素、脂肪和钙、磷、铁等元素，其具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗凝血、抗肿瘤、抗衰老、增强免疫力等功能[1-7]。

黑枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）为茄科枸杞属，含有丰富的脂肪、氨基酸、花青素、VC和大量有益人体的微量元素等，兼具保健作用和药用价值[8]。研究表明，黑枸杞具有抗氧化、益精明目、抗衰老、降低胆固醇的作用，同时对治疗心脏病、月经不调等药效显著[9-14]。

鉴于黑木耳、黑枸杞的保健疗效，本研究以黑木耳、黑枸杞为原料，辅以柠檬酸、蜂蜜、羧甲基纤维素钠、果胶与黄原胶，研制一款营养丰富黑木耳黑枸杞复合饮料。试验为黑木耳、黑枸杞等天然资源的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑木耳、黑枸杞干果及蜂蜜：吉林省长春市沃尔玛超市。

纤维素酶：美国sigma 公司；果胶、磷酸氢二钠、黄原胶、柠檬酸、维生素C、羧甲基纤维素钠等添加剂（食品级）：市售。水杨酸、邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）methyl aminomethane，THAM]（分析纯）：大连美仑生物技术有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl，DPPH）（分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；硫酸亚铁、盐酸、过氧化氢（分析纯）：北京化工厂。

1.2 仪器及设备

UV-2700 型紫外可见分光光度计、AUW120 型电子天平：日本岛津仪器有限责任公司；GZX-9070MBE型电热鼓风干燥箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；WJX-A1000 型高速多功能粉碎机：上海缘沃工贸有限公司；HH-ZK1 型恒温水浴锅：巩义市予华仪器有限责任公司；PHS-3C 型pH 计：上海仪电科学仪器股份有限公司；NTS-4000B 型恒温震荡水槽：日本东京理化器械株式会社；TDL-50B 型低速离心机：上海安亭科学仪器厂；YJGY-100 型高压均质机：天津特斯达食品机械科技有限公司；ATS-06 型打浆机：浙江荣浩工贸有限公司；JIL-80 型胶体磨：温州市长宏轻工机械有限公司。

1.3 工艺流程

1.4 工艺要点

1.4.1 黑木耳汁制备

1）浸提：称量烘干粉碎过的黑木耳粉末，加入30倍体积的蒸馏水，在80 ℃下浸提2 h，重复2 次，离心（4 800 r/min）20 min，保存上清液。

2）酶处理：将浸提液用磷酸缓冲液调pH 值至4.0，加入13 500 U/g 的纤维素酶，置于51 ℃恒温振荡水槽中反应3 h。然后放入沸水中反应10 min 灭活纤维素酶，离心（4 800 r/min）20 min，上清液为黑木耳汁。

1.4.2 黑枸杞汁制备

称取清洗过的黑枸杞干果，料液比 1 ∶10（g/mL），在70 ℃的温度下浸提30 min，打浆后再次浸提30 min，过滤得到黑枸杞汁。

1.4.3 调配

黑木耳汁、黑枸杞汁、蜂蜜、柠檬酸以一定比例在水中混合成原料液后，加入复合稳定剂（羧甲基纤维素钠、果胶与黄原胶按一定配比制得的溶液），调配至成品。

1.4.4 均质

将调配研磨好的料液在20 MPa 压力下进行均质。

1.4.5 灌装与灭菌

将料液加热到95 ℃进行热灌装，然后在100 ℃水中加热杀菌15 min，冷却后制得黑木耳黑枸杞复合饮料。

1.5 原料液配比设置

1.5.1 单因素试验设计

固定黑枸杞汁用量20%、柠檬酸用量0.20%、蜂蜜用量6%，考察黑木耳汁用量（5%、10%、15%、20%、25%、30%）对复合饮料感官评价的影响；固定黑木耳汁用量20%、柠檬酸用量0.20%、蜂蜜用量6%，考察黑枸杞汁用量（5%、10%、15%、20%、25%、30%）对复合饮料感官评价的影响；固定黑木耳汁用量20%、黑枸杞汁用量20%、蜂蜜用量6%，考察柠檬酸用量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%）对复合饮料感官评价的影响；固定黑木耳汁用量20%、黑枸杞汁用量20%、柠檬酸用量0.20%，考察蜂蜜用量（4%、6%、8%、10%、12%、14%）对复合饮料感官评价的影响。

1.5.2 响应面试验设计

在单因素试验基础上，以黑木耳汁用量（A）、黑枸杞汁用量（B）、柠檬酸用量（C）、蜂蜜用量（D）为响应因素，以感官评分（Y）为响应值，采用Design Expert 8.0.6软件，根据Box-Benhnken 中心组合试验设计原理，进行四因素三水平响应面试验，确定复合饮料的最佳配方。试验设计因素与水平见表1。

1.5.3 感官评价测定

由10 名经过食品感官技能培训的教师组成评定小组，根据GB/T 31326-2014《植物饮料》对黑木耳黑枸杞复合饮料给予评价。感官评价标准见表2。

表1 Box-Benhnken 试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels in Box-Benhnken experimental design

表2 复合饮料感官评价表Table 2 Sensory evaluation of compound beverage

1.6 复合稳定剂配比设计

1.6.1 单因素试验设计

向饮料中只添加一种稳定剂不利于其稳定性。为了避免黑木耳黑枸杞复合饮料发生沉淀的现象，向其中加入复配的稳定剂来增强稳定性。

固定果胶用量0.07%、黄原胶用量0.04 %，考察羧甲基纤维素钠用量（0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%）对复合饮料离心沉淀率的影响；固定羧甲基纤维素钠用量0.08%、黄原胶用量0.04%，考察果胶用量（0.01%、0.03%、0.05%、0.07%、0.09%、0.11%）对复合饮料离心沉淀率的影响；固定羧甲基纤维素钠用量0.08%、果胶用量0.07%，考察黄原胶用量（0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%）对复合饮料离心沉淀率的影响。在上述单因素试验中，固定原料液配比为在黑木耳汁20%、黑枸杞汁20%、柠檬酸0.20%条件下，蜂蜜6%。

1.6.2 响应面试验设计

在单因素试验基础上，以羧甲基纤维素钠用量（A）、果胶用量（B）、黄原胶用量（C）为响应因素，以离心沉淀率（Y）为响应值，采用Design Expert 8.0.6 软件，根据Box-Benhnken 中心组合设计原理进行试验，确定复合稳定剂的最佳复配比。试验设计因素与水平见表3。

表3 Box-Benhnken 试验设计因素与水平Table 3 Factors and levels in Box-Benhnken experimental design

1.6.3 离心沉淀率测定

离心沉淀率能反映出溶液的稳定性。离心沉淀率越大，则溶液稳定性越差[15]。将黑木耳黑枸杞饮料搅拌均匀，称取一定质量m1（g），4 000 r/min 离心15 min后，称取沉淀质量m2（g）。按下式计算离心沉淀率：

1.6.4 贮藏稳定性研究

将经过灌装灭菌的产品分别在37 ℃恒温培养箱和4 ℃冰箱存放6 个月，观察有无明显沉淀与分层。

1.7 复合饮料抗氧化性试验

1.7.1 DPPH 自由基清除能力测定

向15 mL 的离心管中加入2 mL 复合饮料和2 mL DPPH-乙醇溶液（0.1 mmol/L），涡旋振荡摇匀，在 37 ℃下避光保存30 min。以无水乙醇为参比，以维生素C作为阳性对照，在517 nm 处测定吸光度值，每个试验平行3 次[16]。清除率按下式计算：

式中：A0为2 mL DPPH-乙醇溶液+2 mL 无水乙醇的吸光度；A1为2 mL DPPH-乙醇溶液+2 mL 复合饮料的吸光度；A2为2 mL 无水乙醇+2 mL 复合饮料的吸光度。

1.7.2 羟自由基清除能力测定

向15 mL 的离心管中加入2 mL 硫酸亚铁溶液（6 mmol/L）、2 mL 过氧化氢溶液（6 mmol/L）、2 mL 水杨酸溶液（6 mmol/L）和 2 mL 复合饮料，在 37 ℃条件下反应1 h。以蒸馏水为参比，以维生素C 作为阳性对照，在517 nm 波长处测定吸光度，每个试验平行3 次[17]。清除率按下式计算：

式中：A0为2 mL 硫酸亚铁溶液+2 mL 过氧化氢溶液+2 mL 水杨酸+2 mL 蒸馏水吸光度；A1为 2 mL 硫酸亚铁溶液+2 mL 过氧化氢溶液+2 mL 水杨酸+2 mL 复合饮料吸光度；A2为2 mL 硫酸亚铁溶液+2 mL 蒸馏水+2 mL 水杨酸+2 mL 复合饮料吸光度。

1.7.3 超氧阴离子自由基清除能力测定

向15 mL 的离心管中加入4.5 mLTris-HCl 缓冲液（50 mmol/L，pH 8.2）和 0.5 mL 复合饮料，摇匀，置于37 ℃条件下预热20 min，然后加入0.5 mL 在37 ℃条件下预热过的邻苯三酚（3mmol/L）。以HCl（10mmol/L）溶液为参比，以维生素C 作为阳性对照，在325 nm 波长下测定吸光度，每个试验平行3 次[18]。清除率按下式计算：

式中：A0为 4.5 mL Tris-HCl 缓冲液+0.5 mL 复合饮料+0.5 mL 邻苯三酚溶液吸光度；A1为4.5 mL Tris-HCl 缓冲液+0.5 mL 复合饮料+0.5 mL 蒸馏水吸光度；A2为 4.5 mL Tris-HCl 缓冲液+0.5 mL 蒸馏水+0.5 mL邻苯三酚溶液吸光度。

2 结果与讨论

2.1 原料液配比

2.1.1 单因素试验

2.1.1.1 黑木耳汁用量的影响

黑木耳汁用量对复合饮料感官评价的影响见图1。

由图1 可知，当黑木耳汁用量为20%时，黑木耳黑枸杞复合饮料的感官评价得分最高，此时其口感适宜。当黑木耳汁浓度偏高时，掩盖了其他成分味道，导致复合饮料口感变差。

2.1.1.2 黑枸杞汁用量的影响

黑枸杞汁用量对复合饮料感官评价的影响见图2。

由图2 可知，随着黑枸杞用量的增大，黑木耳黑枸杞复合饮料的感官评价得分逐渐增大。当黑枸杞汁用量为20%时，其感官评价得分最高。黑枸杞汁浓度偏高时，饮料颜色过深，口感变差。

2.1.1.3 柠檬酸用量的影响

柠檬酸用量对复合饮料感官评价的影响见图3。

图3 柠檬酸用量对复合饮料感官评价的影响Fig.3 The effect of citric acid addition on sensory evaluation of compound beverage

由图3 可知，柠檬酸用量为0.20%时，黑木耳黑枸杞复合饮料的感官评价得分最高。柠檬酸对复合饮料的风味口感有直接干扰，当柠檬酸用量较小时则甜味明显，用量较大则酸味突出，导致饮料口感欠佳。

2.1.1.4 蜂蜜用量的影响

蜂蜜用量对复合饮料感官评价的影响见图4。

图4 蜂蜜用量对复合饮料感官评价的影响Fig.4 The effect of honey addition on sensory evaluation of compound beverage

由图4 可知，蜂蜜用量为6%时，黑木耳黑枸杞复合饮料的感官评价得分最高。当蜂蜜用量较低时，饮料甜味偏淡，稍有苦涩味，而蜂蜜用量较高时，饮料甜味浓郁，会掩蔽原料独有的味道，导致饮料口感欠佳。

2.1.2 响应面优化试验

2.1.2.1 试验结果

根据单因素试验结果，利用响应面法优化黑木耳黑枸杞复合饮料的配方。根据响应面Box-Behnken 设计29 组试验，其中5 组中心试验进行试验误差估测，其余24 组用于分析因点。具体试验设计及结果见表4。

表4 Box-Behnken 试验设计及结果Table 4 The design and results of Box-Behnken experments

采用Design-Expert 8.0.5 软件对表4 数据进行二次多项式回归分析，获得感官评价（Y）对黑木耳汁用量（A）、黑枸杞汁用量（B）、柠檬酸用量（C）、蜂蜜用量（D） 的二次多项回归方程：Y=89.92-1.71A+0.57B-0.50C-2.54D+3.15AB-0.57AC+1.20AD-1.45BC-1.25BD+0.47CD-1.91A2-1.72B2-2.47C2-0.68D2。

对上述回归方程进行方差分析，结果如表5 所示。

表5 回归方程方差分析表Table 5 Analysis of variance for response surface quadratic model

由表5 可知，该模型P＜0.000 1 表明二次回归模型极显著；决定系数R2为0.975 9，表示感官评价试验值与模拟回归值有很好的一致性。此外，R2Adj和R2的值非常接近，即证明有足够大的样本容量。另外，该模型的变异系数（C.V）为0.75%，说明了其高重复性，试验值具有较高的精确度和良好的可靠性。精密度为25.304，远大于4，说明该模型可以用来对试验结果进行拟合。失拟项P=0.753 1＞0.05，即失拟项不显著，表示此方程可以较好的描述各条件和感官评价的关系，所以可用此模型来分析和预测黑木耳汁用量、黑枸杞汁用量、柠檬酸用量、蜂蜜用量对黑木耳黑枸杞复合饮料感官评价的影响。

从四因素[黑木耳汁用量（A）、黑枸杞汁用量（B）、柠檬酸用量（C）、蜂蜜用量（D）]对复合饮料感官评价（Y）的影响来分析：回归方程的一次项A、B、D、二次项A2、B2、C2以及交互项 AB、AD、BC、BD 对感官评价的影响极显著（P＜0.01），一次项 C 及二次项 D2对感官评价的影响显著（P＜0.05），由此可见各因素对感官评价的响应不是简单的线性关系。从F 值可以看出对复合饮料感官评价的影响因素排序为蜂蜜用量>黑木耳汁用量>黑枸杞汁用量>柠檬酸用量。

2.1.2.2 响应面分析

各因素交互作用对感官评价影响的响应面图见图5。

图5 各因素交互作用对感官评价影响的响应面图Fig.5 Response surface plots showing the interactive effects of various factors on sensory evaluation

图5 反映了黑木耳汁用量（A）、黑枸杞汁用量（B）、柠檬酸用量（C）、蜂蜜用量（D）4 个因素之间的交互作用及对复合饮料感官评价的影响。响应面坡度越陡表明响应值对于处理条件的改变非常敏感，反之则影响不大[19]。等高线越近似椭圆形表明两因素交互作用越强，反之，等高线越近似圆形表明两因素交互作用越弱[20]。由方差分析及响应面可知，黑木耳汁用量和黑枸杞汁用量的交互作用最强，其次是黑枸杞汁用量和柠檬酸用量的交互作用，然后是黑枸杞用量和蜂蜜用量的交互作用，而黑木耳汁用量和蜂蜜用量的交互作用最弱。

2.1.2.3 验证试验

由软件Design-Expert8.0.5 优化可得，黑木耳黑枸杞复合饮料中的最优配方为：黑木耳汁用量16.28%、黑枸杞汁用量17.87%、柠檬酸用量0.20%、蜂蜜用量6.11%，理论感官评分为92.7 分。考虑到操作的方便性，将最佳配方用量调整为，黑木耳汁16%、黑枸杞汁18%、柠檬酸0.20%、蜂蜜6%。在此条件下做3 次重复试验，得到感官评分为91.7 分，与预测值接近。

2.2 复合稳定剂配比

2.2.1 单因素试验结果

2.2.1.1 羧甲基纤维素钠用量的影响

羧甲基纤维素钠用量对离心沉淀率的影响见图6。

图6 羧甲基纤维素钠用量对离心沉淀率的影响Fig.6 The effect of carboxymethyl cellulose sodium content on centrifugation sedimentation rate

由图6 可知，羟甲基纤维素纳用量在0.08%时，黑木耳黑枸杞复合饮料的离心沉淀率下降趋于稳定，说明此时体系趋于稳定。当其用量小于0.08%时，复合饮料离心沉淀率较大、稳定性较差，当其用量大于0.08%时，黑木耳黑枸杞复合饮料离心沉淀率较小、稳定性较好，但粘稠度较高，影响口感。

2.2.1.2 果胶用量的影响

果胶用量对离心沉淀率的影响见图7。

图7 果胶用量对离心沉淀率的影响Fig.7 The effect of pectin content on centrifugation sedimentation rate

由图7 可知，果胶用量为0.07%时，黑木耳黑枸杞复合饮料的离心沉淀率下降趋于稳定。当果胶用量大于0.07%时，黑木耳黑枸杞复合饮料太过粘稠，影响口感。

2.2.1.3 黄原胶用量的影响

黄原胶用量对离心沉淀率的影响见图8。

图8 黄原胶用量对离心沉淀率的影响Fig.8 The effect of xanthan gum content on centrifugation sedimentation rate

由图8 可知，黄原胶用量为0.04%时，黑木耳黑枸杞复合饮料的离心沉淀率下降趋于稳定。当用量大于0.04%时，黑木耳黑枸杞复合复合饮料离心沉淀率较小，说明其稳定性较好，但此时饮料过于黏稠，不利于口感。

2.2.2 响应面优化

2.2.2.1 试验结果

根据单因素试验结果，利用响应面法对复合稳定剂的复配比进行优化。根据响应面Box-Behnken 设计17 组试验，其中5 组中心试验进行试验误差估测，其余12 组用于分析因点。具体试验设计及结果见表6。

采用Design-Expert 8.0.5 软件对表6 数据进行二次多项式回归分析，获得离心沉淀率（Y）对羧甲基纤维素钠用量（A）、果胶用量（B）、黄原胶用量（C）的二次多项回归方程：Y=1.05-6.250×10-3A-0.045B-0.019C+0.027AB-0.035AC-2.500×10-3BC+0.068A2+0.10B2+0.11C2。对上述回归方程进行方差分析，结果如表7 所示。

表6 Box-Behnken 试验设计及结果Table 6 The design and results of Box-Behnken experments

表7 回归方程方差分析表Table 7 Analysis of variance for response surface quadratic model

由表7 可知，该模型P＜0.000 1 表明二次回归模型极显著；决定系数R2为0.990 2，说明离心沉淀率的试验值与模拟回归值一致。此外，R2Adj和R2的值非常接近，即证明有足够大的样本容量。另外，该模型的变异系数（C.V）为1.26%，表示其高重复性，试验值具有较高的精确度和良好的可靠性。精密度为24.123，远大于4，说明该模型可以用来对试验结果进行拟合。失拟项P=0.974 3＞0.05，即失拟项不显著，说明该方程可以较好的描述各条件和离心沉淀率的关系，因此可用此模型来分析和预测羧甲基纤维素钠用量、果胶用量、黄原胶用量对复合饮料离心沉淀率的影响。

从三因素[羧甲基纤维素钠用量（A）、果胶用量（B）、黄原胶用量（C）]对复合饮料离心沉淀率（Y）的影响来分析：回归方程的一次项B、C、二次项A2、B2、C2以及交互项AB、AC 对离心沉淀率的影响极显著（P＜0.01），由此可见各因素对离心沉淀率的响应不是简单的线性关系。从F 值可以看出对复合饮料离心沉淀率的影响因素排序为果胶用量＞黄原胶用量＞羧甲基纤维素钠用量。

2.2.2.2 响应面分析

各因素交互作用对离心沉淀率影响的响应面图见图9。

图9 各因素交互作用对离心沉淀率影响的响应面图Fig.9 Response surface plots showing the interactive effects of various factors on centrifugation sedimentation rate

图9 反映了羧甲基纤维素钠用量（A）、果胶用量（B）、黄原胶用量（C）3 个因素之间的交互作用及对黑木耳黑枸杞复合饮料离心沉淀率的影响。从图9 可知，稳定剂有利于黑木耳黑枸杞复合饮料离心沉淀率的下降。由方差分析及响应面可以看出，羧甲基纤维素钠用量和果胶用量的交互作用最强，其次是羧甲基纤维素钠用量和黄原胶用量的交互作用，而果胶用量和黄原胶用量的交互作用最弱。

2.2.2.3 验证试验

由响应面法分析可得，饮料中复合稳定剂最佳配比参数为：羧甲基纤维素钠用量0.08%、果胶用量0.07%、黄原胶用量0.04%，离心沉淀率最低预测值1.04%。按照上述配比，做3 次重复试验，测得黑木耳黑枸杞复合饮料的实际离心沉淀率为1.05%，与预测结果相近。饮料放置6 个月后，无明显沉淀与分层。

2.3 复合饮料抗氧化性试验

通过测定黑木耳黑枸杞复合饮料和维生素C 对DPPH 自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基的清除能力，来检测复合饮料的抗氧化活性，结果见如表8所示。

表8 复合饮料对3 种自由基的清除率Table 8 The scavenging rate of compound beverage against three kinds of oxygen radicals

从表8 可以看出，黑木耳黑枸杞复合饮料具有一定的抗氧化活性，其对DPPH 自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基的清除能力分别达到59.20%、43.60%、67.45%。

3 结论

本文以黑木耳、黑枸杞为原料，以柠檬酸、蜂蜜、羧甲基纤维素钠、果胶与黄原胶为辅料研制黑木耳黑枸杞复合饮料。通过单因素与响应面试验确定黑木耳黑枸杞复合饮料中原料液最佳配比参数为：黑木耳汁用量16%、黑枸杞汁用量18%、柠檬酸用量0.20%、蜂蜜用量6%，感官评价达到91.7 分；通过单因素与响应面试验确定黑木耳黑枸杞复合饮料中复合稳定剂的最佳配比参数为：羧甲基纤维素钠用量0.08%、果胶用量0.07%、黄原胶用量0.04%，离心沉淀率为1.05%。根据上述最佳配比参数制得的复合饮料颜色呈紫红色，具有黑木耳与黑枸杞特有的风味，酸甜适中，无明显沉淀与分层。该复合饮料还具有较好的抗氧化活性，对DPPH 自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基的清除能力达到59.20%、43.60%、67.45%，因而具有较好的推广前景。