副干酪乳杆菌VL8胞外多糖对巨噬细胞RAW264.7免疫激活作用研究

李琪，杜佳峰，高洁，刘晓宇，王向红，桑亚新

（河北农业大学食品科技学院，河北保定071001）

巨噬细胞是一类由单核细胞分化而来、具有防卫作用的免疫细胞[1]。巨噬细胞以不同形式广泛分布于机体不同组织中，其不但参与机体的特异性免疫反应和非特异性免疫反应，而且是两种免疫反应联系的“桥梁细胞”[2]。巨噬细胞膜上的非特异性受体－外源性凝集素B 为糖蛋白，通过其终端的-OH 基与多糖-H基结合，启动了细胞内环化酶系统，致使细胞内酶的分泌及活性增加，细胞代谢提高，从而奠定了巨噬细胞活化的基础[3]。活化的巨噬细胞具有定向运动和吞噬功能，能够吞噬外来异物或直接杀死病原体和肿瘤细胞，还能分泌多种活性物质（如活性氧（reactive oxygen species，ROS）、NO 和细胞因子等）来参与机体的免疫应答等，同时还能够传递抗原[4-5]。这些均与细胞内酶的活性有关。

天然多糖主要来源于细菌、真菌、藻类和高等植物等组织中，具有复杂的结构和多种生物活性，如免疫调节，抗肿瘤，抗炎症，抗病毒即抗氧化等，是一种有效的生物应答调节剂[6-7]。越来越多的药理和临床研究表明，多糖作为药物，其细胞毒性较小，并且可激活巨噬细胞的免疫反应。近年来微生物来源的胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）逐渐取代了传统的植物多糖而越来越受到人们重视。微生物多糖由于其生产周期短，不受季节、气温等条件限制，具有较强的市场竞争力和广阔的发展前景[8]。国内外大量研究表明，乳酸菌EPS 具有一定的免疫调节活性，既能激活非特异性免疫中的巨噬细胞和NK 细胞等免疫细胞，提高机体免疫分子的分泌能力；又能作用于特异性免疫系统，激活T 淋巴细胞产生淋巴因子，刺激B 淋巴细胞产生抗体等。但是，由于乳酸菌胞外多糖结构的复杂性和来源的广泛性，在机理上是如何发挥免疫调节作用依然不清楚。由于乳酸菌EPS 具有菌株特异性，不同菌株产生的EPS 差异性很大，不同的EPS 具有各自特定的功能，因此在对新分离的乳酸菌EPS 的功能筛选时，对其进行免疫活性的研究是很有必要的[9-10]。

Viili 是一种源自于芬兰的传统发酵乳制品，有研究表明Viili 黏稠性是由其中乳酸菌产生的胞外多糖所致[11]。Viili 中的这种胞外多糖具有降低血液胆固醇含量、抗肿瘤及促进益生菌与肠粘膜的吸附等重要的生理活性[12]。多糖对巨噬细胞的基本作用就是刺激巨噬细胞，使其活力增强，提高胞内酶活力，并释放多种活性物质。本试验以副干酪乳杆菌VL8 胞外多糖（VL8-EPS） 为研究对象，研究其对巨噬细胞RAW264.7 胞内酶（SOD、iNOS）及活性氧（H2O2、O2-）的影响，初步探讨VL8-EPS 对巨噬细胞的激活机理。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

细胞株：国家实验细胞资源共享服务平台，小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7，此细胞株源自BALB/c 小鼠由Abelson 鼠科白血病病毒诱导的肿瘤。

VL8-EPS 实验室制备；DMEM 培养基、迪夫快速染色液（Diff-Quik Stain）试剂盒、超氧阴离子（oxygen free radical，OFR）含量检测试剂盒：北京索莱宝科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测定试剂盒、过氧化氢（H2O2）测试盒、一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，NOS）试剂盒：南京建成生物工程研究所；细胞蛋白抽提与BCA 蛋白定量试剂盒：北京康为世纪生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

FA2004 电子天平：上海舜宇有限公司；CO2培养箱CB160：Binder 公司；1500-823 型酶标仪：Thermo Sci entific 公司；SW-CJ-1FD 型超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；YS100 显微镜：Nikon 仪器公司；Feb-80 电动离心机：天津市华北实验仪器有限公司；K5600型超微量分光光度计：北京凯奥科技发展有限公司（KAIAO）。

1.3 方法

1.3.1 RAW264.7 细胞活化与培养

将细胞冻存管从液氮罐中取出，迅速在37 ℃恒温水浴锅中进行解冻。然后于超净台无菌操作，将细胞及冻存液转移到含有5 mL 高糖DMEM 培养液的离心管中，1 000 r/min 离心 3 min～5 min，轻轻弃掉上清，保留离心管底的细胞，再用含有10 % 胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的DMEM 培养液重悬细胞，最后，将细胞悬液置于细胞培养瓶中37 ℃、5%CO2的条件下培养。

1.3.2 VL8-EPS 对RAW264.7 细胞形态的影响

将 RAW264.7 细胞按 5×105个/mL 接种在 12 孔板中，试验分为空白对照组（不加VL8-EPS 和LPS），VL8-EPS 处理组（终浓度分别为 50、200、400、800 μg/mL），脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）阳性对照组（终浓度为 10 μg/mL），于 37 ℃、5%CO2培养箱中 24 h 后弃上清，磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤3 次。用500 μL Diff-Quik 固定剂固定细胞20 s，之后用 500 μL Diff-QuikⅠ染色 5 s～10 s，然后用 500 μL Diff-QuikⅡ染色10 s～20 s。最后，用PBS 洗涤后，趁湿在倒置显微镜下观察细胞形态。

1.3.3 VL8-EPS 对RAW264.7 细胞iNOS 酶活力的影响

将 RAW264.7 细胞按 5×105个/mL，加入 6 孔板中，每孔2 mL。试验分为空白对照组（不加VL8-EPS和 LPS），VL8-EPS 处理组 （终浓度分别为 50、100、200、400、800 μg/mL），LPS 阳性对照组 （终浓度为10 μg/mL），于 37 ℃、5 % CO2培养箱中 24 h 后弃上清，PBS 洗涤 3 次，每孔加 200 μL RIPA 裂解液，于冰上孵育20 min，使细胞充分裂解。离心取上清，蛋白质定量（bicinchoninic acid，BCA）法测定蛋白浓度后，根据一氧化氮合酶测定试剂盒说明书测定iNOS 酶活力。

1.3.4 VL8-EPS 对 RAW264.7 细胞 SOD 酶活力的影响

将 RAW264.7 细胞按 5×105个/mL，加入 6 孔板中，每孔2 mL。试验分为空白对照组（不加VL8-EPS和 LPS），VL8-EPS 处理组 （终浓度分别为 50、100、200、400、800 μg/mL），LPS 阳性对照组 （终浓度为10 μg/mL），于 37 ℃、5 % CO2培养箱中 24 h 后弃上清，PBS 洗涤 3 次，每孔加 200 μL RIPA 裂解液，于冰上孵育20 min，使细胞充分裂解。离心取上清，BCA 法测定蛋白浓度后，根据超氧化物歧化酶测定试剂盒说明书测定SOD 酶活力。

1.3.5 VL8-EPS 对 RAW264.7 细胞分泌 O2-的影响

将 RAW264.7 细胞按 5×105个/mL，加入 96 孔板中，每孔100 μL。试验分为空白对照组（不加VL8-EPS和 LPS），VL8-EPS 处理组 （终浓度分别为 50、100、200、400、800 μg/mL），LPS 阳性对照组 （终浓度为10 μg/mL），每组设置 6 个重复，于 37 ℃、5%CO2培养箱中24 h 后，取细胞培养液，按照超氧阴离子含量检测试剂盒说明书添加试剂，混匀，8 000 r/min，25 ℃，离心 5 min，小心吸去上层水相 200 μL，530 nm 处测定吸光值，根据标准曲线计算O2-的含量。

1.3.6 VL8-EPS 对 RAW264.7 细胞分泌 H2O2的影响

将 RAW264.7 细胞按 5×105个/mL，加入 24 孔板中，每孔1mL。试验分为空白对照组（不加VL8-EPS 和LPS），VL8-EPS 处理组（终浓度分别为 50、100、200、400、800 μg/mL），LPS 阳性对照组（终浓度为 10 μg/mL），每组设置 3 个重复，于 37 ℃、5%CO2培养箱中 24 h 后，取上清液，按照过氧化氢测试盒说明书测定H2O2的含量。

1.3.7 统计分析

试验数据均由SPSS 17.0 进行分析，结果以平均数±标准差（X±SD）表示。各组求平均值后，两两对比，进行单因素方差分析（one-way ANOVA）。P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 VL8-EPS对RAW264.7细胞形态的影响

使用Diff-Quik 染色试剂盒观察细胞的形态，结果如图1 所示。

图 1 VL8-EPS 对 RAW264.7 细胞形态的影响（200×）Fig.1 Effect of VL8-EPS on RAW264.7 cells morphologic（200×）

从图1 中可以看出，在空白对照组中，未激活的RAW264.7 细胞大多呈圆形。与空白对照组相比，VL8-EPS 处理的细胞出现明显的形态变化，开始出现不规则多边形。与阳性对照LPS 组相似，一些细胞延伸显示典型活跃状态的伪足，浓度较高，巨噬细胞显得更长，更多角形。结果表明VL8-EPS 具有与LPS 相似的功能，能够改变巨噬细胞形态，激活细胞。但变形比例明显小于LPS 组。

2.2 VL8-EPS对RAW264.7细胞iNOS酶活力的影响

VL8-EPS 对RAW264.7 细胞iNOS 酶活力的影响如图2 所示。

图2 VL8-EPS 对RAW264.7 细胞iNOS 酶活力的影响Fig.2 Effect of VL8-EPS on the activity of iNOS in RAW264.7 cell

由图2 可知，不同浓度的VL8-EPS 均能够提高RAW264.7 细胞iNOS 酶活力，其活力显著高于空白对照组（P＜0.01），并且随着 VL8-EPS 浓度的增大，iNOS酶活力提高，具有一定的量效关系。在800 μg/mL 时，其酶活力达到25.80 U/mgprot，较空白对照组提高了104.64%，且显著高于阳性对照 LPS 组（P＜0.01）。结果表明，VL8-EPS 在 50 μg/mL～800 μg/mL 浓度范围内，能够激活巨噬细胞，促进细胞iNOS 酶活力增加。

2.3 VL8-EPS对RAW264.7细胞SOD酶活力的影响

VL8-EPS 对RAW264.7 细胞SOD 酶活力的影响如图3 所示。

图3 VL8-EPS 对RAW264.7 细胞SOD 酶活力的影响Fig.3 Effect of VL8-EPS on the activity of SOD in RAW264.7 cell

由图3 可知，与空白对照组相比，不同浓度的VL8-EPS 均能提高RAW264.7 细胞SOD 酶活力，其中浓度达到 200 μg/mL 后达到极显著差异（P＜0.01），且SOD 酶活力随着VL8-EPS 浓度的增加而增加，呈现出一定的量效关系。其结果与LPS 组类似，并在浓度为800 μg/mL 时，SOD 酶活力达到 7.44 U/mgprot，较空白对照组提高了10.30 %，且高于LPS 组。结果说明VL8-EPS 在 50 μg/mL～800 μg/mL 浓度范围内，可以激活巨噬细胞，提高SOD 酶活力。

2.4 VL8-EPS对RAW264.7细胞分泌O2-的影响

VL8-EPS 对RAW264.7 细胞分泌O2-的影响如图4 所示。

如图4 所示，与空白对照组相比，除50 μg/mL 浓度外，其余各组浓度的VL8-EPS 均极显著提高了巨噬细胞分泌 O2-水平（P＜0.01），并随着浓度的增大，O2-分泌量增加，呈一定的量效关系。在800 μg/mL 时，O2-含量最高，较空白对照组提高了666.87%，但其分泌量远低于阳性对照LPS 组。结果表明，VL8-EPS 能够激活巨噬细胞，在 50 μg/mL～800 μg/mL 浓度范围内能够促进巨噬细胞分泌O2-。

图4 VL8-EPS 对RAW264.7 细胞分泌O2-的影响Fig.4 Effect of VL8-EPS on O2-secretion in RAW264.7 cell

2.5 VL8-EPS对RAW264.7细胞分泌H2O2的影响

VL8-EPS 对RAW264.7 细胞分泌H2O2的影响如图5 所示。

图5 VL8-EPS 对RAW264.7 细胞分泌H2O2 的影响Fig.5 Effect of VL8-EPS on H2O2 secretion in RAW264.7 cell

由图5 可知，与空白对照组相比，不同浓度的VL8-EPS 均能显著促进巨噬细胞释放H2O2（P＜0.05，P＜0.01），随着多糖浓度的增加，H2O2释放量增加，具有一定的量效关系。其中，在最大多糖浓度时，其分泌量达到了16.00 mmol/L，较空白对照组提高了81.78%，并且高于阳性对照LPS 组。结果表明，VL8-EPS 在50 μg/mL～800 μg/mL 浓度范围内，能够促进巨噬细胞分泌H2O2活性氧，起到杀灭病原微生物的作用。

3 讨论

巨噬细胞是机体免疫系统中的重要成分之一，作为免疫效应细胞起作用，广泛参与免疫系统的调节。人体内抗微生物和寄生虫感染的主要效应细胞是巨噬细胞[13-14]。不少研究表明活化后的巨噬细胞在吞噬异物的过程中会释放大量释放多种免疫活性物质，如溶菌酶，髓过氧化物酶，乳铁蛋白，防御素，活性氧物质，活性氮物质等，以其清除异物[15-16]。

研究表明，当巨噬细胞受到外界物质的刺激后，形态会发生改变，增加细胞表面积，提高吞噬能力[17-18]。本研究发现，添加VL8-EPS 的RAW264.7 细胞经过一段时间的共培养，其细胞形态发生明显变化。表现为圆形、椭圆、菱形、梭形或者不规则形，还可见较长的伪足。没添加药物不被激活的细胞一般呈圆形、椭圆形，很少见有突起。表明VL8-EPS 能够活化巨噬细胞，促进其形态变化。同时，激活的巨噬细胞能明显提高巨噬细胞胞内酶的活性。NO 是活化巨噬细胞杀伤肿瘤细胞和病原微生物的一个重要效应分子，激活的巨噬细胞表达NO 合成酶（NOS），利用L-精氨酸合成NO[19]。作为NO 合成中的关键酶，NOS 调节和影响生物活性。目前，有 3 种 NOS 亚型称为神经元 NOS（nNOS），内皮NOS（eNOS）和诱导型 NOS（iNOS）。nNOS 和 eNOS 在细胞的生理状态中表达，其是Ca2+依赖性的。然而，iNOS 主要存在于巨噬细胞中，并且被认为在被非Ca2+依赖性的细胞因子刺激后不表达。SOD 作为体内抗氧化酶系统的主要成分，体内高水平的氧自由基主要来源于免疫和炎症过程。SOD 是机体代谢的关键酶，它能催化体内分子氧活化的第一个中间产物超氧阴离子自由基（O2-·）的歧化反应而形成氧分子和过氧化氢。这些生成物对细胞仍会造成损害，可被过氧化氢酶及硒谷胱甘肽过氧化物酶等酶进一步无毒化[20]。生成的O2-和H2O2等活性氧成分是杀灭入侵病原微生物的主要成分[21]。陈伟珠[22]研究发现猪茯苓多糖能够提高巨噬细胞iNOS 活性。程安玮[23]发现甘草多糖可以激活巨噬细胞，提高SOD，iNOS 酶活力，促进巨噬细胞释放O2-。徐智敏[24]发现L.casei 胞外多糖能够提高巨噬细胞O2-和H2O2水平。本试验研究结果发现，VL8-EPS 促进巨噬细胞形态改变，提高了iNOS、SOD 的活性，同时促进释放O2-和H2O2活性氧，激活了巨噬细胞。结果说明VL8-EPS 作为一种食品级来源的活性多糖，对巨噬细胞无明显毒副作用，并且能够激活巨噬细胞分泌活性物质，提高免疫调节能力，是理想的天然免疫佐剂。本研究结果与程安玮[23]，徐智敏[24]等的结果一致。

4 结论

VL8-EPS 能够激活RAW264.7 细胞，促使细胞形态学发生改变，提高巨噬细胞胞内酶iNOS 及SOD 酶活力，同时促进细胞分泌O2-和H2O2活性氧。由此表明，VL8-EPS 可能是通过促进巨噬细胞胞内酶活力及分泌活性氧来发挥免疫调节作用，提示VL8-EPS 可以作为一种潜在免疫调节剂激活巨噬细胞，发挥免疫增强功能。关于VL8-EPS 对巨噬细胞免疫功能的影响机制有待于进一步研究。