轮状病毒为主的混合感染性犊牛腹泻病的诊断

彭清洁，刘 心，晁 金，杨 莉，陈 鸣，薛凯丽 ，张淏云，朱 杰,朱小洁，陈颖钰,3,4,胡长敏,3，陈 曦,3，郭爱珍,3,4*

(1.华中农业大学 动物医学学院，湖北 武汉 430070;2.国家肉牛产业技术体系疾病控制功能研究室，湖北 武汉 430070；3.华中农业大学 农业微生物学国家重点实验室，湖北 武汉 430070;4.湖北省兽医流行病学国际科技合作基地，湖北 武汉 430070)

随着我国奶牛养殖规模的不断扩大，犊牛腹泻的危害已经引起了广泛关注。犊牛腹泻的高发病率和高死亡率是造成牧场经济损失的主要原因之一，且影响奶牛后期的生长性能。除了饲养管理条件的原因，大肠杆菌K99+、牛轮状病毒、小球隐孢子虫、牛冠状病毒也被认为是导致犊牛腹泻的主要病原[1]。

新生犊牛中轮状病毒引起的犊牛腹泻较为常见，一般 0～10 日龄易感。据报道，牛轮状病毒广泛存在于犊牛。在犊牛出生2周内，牛轮状病毒的分离率高达94%[2]。同时，轮状病毒引起的肠细胞损伤更有利于产毒素性大肠杆菌的附着和感染，这种混合感染可导致犊牛发生更严重的腹泻和更高的死亡率[3]。

1 材料与方法

1.1 病例背景2019年4月13号，研究室接到内蒙古某牛场的电话咨询，通过农场主描述得知：该场共1 608头黑安格斯牛，均为澳大利亚进口，其中犊牛350头。牛场从3月末4月初开始，3日龄犊牛陆续开始出现腹泻现象，拉黄色稀粪，用土霉素、氟尼辛葡甲胺注射液、樟脑磺酸钠、碳酸氢钠药物治疗后少数牛病情有所好转，但随即复发；腹泻牛4～5 d后粪便转为白、灰色稀粪。犊牛发病率为28.5%(100/350)，病死率为5.7%(20/350)。为确诊病因，研究室展开了对该场的现场调查及实验室检测工作。

1.2 现场调查2019年4月14日研究室赴发病牛场进行现场调查。该场犊牛表现为严重的精神沉郁，四肢无力，脱水；7头犊牛卧地不起；犊牛粪便为黄色、白色、灰色稀粪或绿色粪便,部分给药后牛粪便为绿色、黄色。5头牛死亡。对死亡犊牛进行剖检显示，肠黏膜充血、出血(图1)，肠系膜淋巴结肿大，皱胃有大量凝乳块，胃黏膜出血，易脱落(图2)。

图1 肠黏膜充血、出血 图2 皱胃有大量凝乳块，胃黏膜出血

1.3 样本的采集与实验室检测采集新发病而未用药的犊牛(4头)、用药犊牛(3头)和同群无明显腹泻症状犊牛(2头)的血样及粪样，血样用于牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的检测，粪样用于多抗原(牛轮状病毒、冠状病毒、大肠杆菌K99和小球隐孢子虫)的检测。利用双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒(购自Bio-X公司)对所采集的粪便样品进行多病原检测，包括牛轮状病毒、冠状病毒、大肠杆菌K99、小球隐孢子虫4种病原。提取血清中RNA后利用RT-PCR方法对(BVDV)进行病原检测[4]。将粪便样品接种TSA平皿及麦康凯培养基进行细菌分离。利用PCR对所分离出来的大肠杆菌进行K88核酸检测[5]。

2 结果

2.1 轮状病毒检测77.8%(7/9)的粪样为轮状病毒阳性。其中，100%(4/4)的新发病而未用药犊牛、33.3%(1/3)的用药犊牛及100%(2/2)的无明显腹泻症状犊牛为轮状病毒抗原检测阳性，表明该场存在普遍性感染轮状病毒的情况。11.1%(1/9)的粪便样品为冠状病毒抗原及小球隐孢子虫抗原检测阳性，且来自于同一头无明显腹泻症状犊牛；所有的9份犊牛样品中均未检出大肠杆菌K99抗原。在所有的9头犊牛中，11.1%(1/9)的犊牛为轮状病毒、冠状病毒和小球隐孢子虫混合感染。具体结果见表1。

2.2 BVDV的检测9头犊牛血液样本中33.3%(3/9)为BVDV阳性，包括1头用药犊牛，2头无明显腹泻症状犊牛(图3)，表明该场存在有BVDV的感染。

2.3 大肠杆菌的分离鉴定粪便样品所涂布的TSA平皿中长出灰白色圆形菌落；麦康凯培养基平皿中长出粉红色菌落，疑似大肠杆菌。对长出的菌落进行16S rRNA测序，结果显示所分离的细菌为大肠杆菌。

表1 9头犊牛的牛轮状病毒、冠状病毒、大肠杆菌K99、小球隐孢子虫粪样病原检测结果

图3 血清样本中BVDV 病原检测结果 M.DL5000 DNA Marker； 1～3.用药犊牛； 4,5.无明显腹泻症状犊牛； 6～10.新发病而未用药犊牛； 11.阴性对照； 12.阳性对照

2.4 大肠杆菌K88的核酸检测每个犊牛样本挑取2～3个菌落进行检测，结果显示，1头无明显腹泻症状犊牛和1头发病犊牛粪便样本出现K88特异性条带(图4)。

2.5 药敏试验用纸片法检测所分离的大肠杆菌对10种常见药物的敏感性[6]，结果显示大肠杆菌对庆大霉素和卡那霉素敏感，对红霉素、阿莫西林、四环素、氟苯尼考、青霉素和环丙沙星6种药物耐药(表2)。

3 讨论

牛轮状病毒、冠状病毒、大肠杆菌K99和小球隐孢子虫是临床上导致犊牛腹泻的主要病原[7]，因此在本案例中对该些病原进行了抗原检测。由于轮状病毒抗原检测阳性率极高，为77.8%，因此推断轮状病毒为导致本场犊牛腹泻的主要病原。为了解牛场整体的感染情况，我们对无明显腹泻症状犊牛也进行了检测，发现在无明显腹泻症状的犊牛中也有该病原的存在；不仅如此，BVDV也存在于无明显症状的犊牛，表明该场同时存在有轮状病毒及BVDV的感染。由于各头犊牛感染期存在有差异，因此临床症状上存在有差别。

图4 大肠杆菌K88核酸PCR扩增结果 M.DL2000 DNA Marker； 1～29.犊牛样本；30.阴性对照；31.阳性对照

表2 大肠杆菌药敏试验结果

此外，出现了多种病原同时在1头牛中出现的结果，表明该场犊牛腹泻存在有共感染情况，且同时也不可排除其他病原存在有潜伏感染的情况。另1头犊牛虽然无明显腹泻症状，但实验室检测结果显示已经感染了轮状病毒、BVDV和大肠杆菌K88混合感染，需要尽快治疗。

目前，国内尚无针对牛轮状病毒的特效药物和商品化的疫苗。对于牛轮状病毒感染，主要采取补液措施防脱水，并纠正电解质紊乱等非特异性支持疗法。可用微生态制剂饮水，辅助治疗，并促进胃肠道功能恢复。根据药敏试验结果，可用庆大霉素、卡那霉素对感染大肠杆菌K88的犊牛进行治疗，且在治疗过程中应考虑该病毒的协同致病作用。

另外也应从生物安全和农场管理方面给出相关建议。首先消除传染源，切断传播途径是重要控制手段，故应加强隔离、清洁和消毒等手段；对于腹泻病犊牛，建议单栏关养，及时清除病畜粪便，并进行消毒，防止粪便污染食物和饮水，导致传播；犊牛吃奶前要消毒乳房，防止交叉感染。其次用0.01%碘、1%次氯酸钠和70%酒精可使病毒丧失感染力，所以也应同时注意对清洁工具的消毒，防止粪中病毒随清粪工具传播。最后，也应增强牛体抵抗力，增加保温措施，保持犊牛舍温暖，及时更换垫草，保持干燥，保证及时和充足地饮用初乳和常乳。