非生物胁迫对转基因抗虫棉Bt蛋白表达量的影响

常丽娟，刘文娟，张富丽，王 东，宋 君

(四川省农业科学院分析测试中心，四川 成都 610066)

【研究意义】自然界中植物生长受到各种生物胁迫和非生物胁迫的影响，非生物胁迫可分为温度胁迫、水分胁迫、盐胁迫、矿物质缺乏等因素，是制约植物生长发育、影响作物产量和质量的关键因子。转基因抗虫棉是我国商业化种植面积最大的转基因农作物，20世纪90年代我国研制了具有自主知识产权的第一代转Bt基因抗虫棉，成功抵御住了棉铃虫的危害，极大提高了转基因抗虫棉的市场占有率，国产转基因抗虫棉在遏制棉铃虫爆发、降低农药使用、节约生产成本等方面取得了世人瞩目的成就，带来了巨大的社会和经济效益。因此，研究非生物胁迫与转基因抗虫棉外源Bt蛋白表达量的关系可以指导转基因抗虫棉的田间种植，避免环境因素对抗性的影响，具有重要的研究意义。【前人研究进展】非生物胁迫可导致水稻[1-2]、小麦[3]、玉米[4]等作物花粉药隔维管束结构异常，导致花粉败育。王晓宇等[5]对小麦幼苗进行4种非生物胁迫处理，发现非生物胁迫抑制小麦的生长，植株干枯矮小，根和叶片不同程度变短，根、茎、叶中可溶性总蛋白含量升高。非生物胁迫对转基因抗虫棉外源蛋白表达量存在影响。张祥等[6]研究发现，高温条件下不同湿度处理4种转基因抗虫棉，盛蕾期抗虫棉Bt蛋白含量与CK无差异，盛花期和盛铃期高温高湿处理抗虫棉Bt蛋白含量不同程度下降。王家宝等[7]研究发现，花铃期田间渍涝或土壤缺水干旱，可显著降低棉株不同器官的Bt蛋白含量。【本研究切入点】本试验盆栽种植黄河流域和长江流域具有代表性的抗虫棉品种中棉45号和鄂抗虫棉1号，同时设置8种非生物胁迫条件，对2种转基因抗虫棉根、茎、叶中Bt蛋白含量进行检测。【拟解决的关键问题】本试验旨在探究非生物胁迫对Bt蛋白表达量的影响，避免不利环境因素降低转基因抗虫棉的抗性，为转基因抗虫棉田间种植提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料与土壤 试验所用的转Bt 基因抗虫棉品种由中国农科院棉花研究所提供；种植转基因抗虫棉的土壤为大田土壤与市场购买营养土按2∶1配制而成的混合土，土壤pH 6.2～6.8，偏酸性，土壤有机质含量3.56 %，全氮 1.2 g·kg-1，速效磷 12.1 mg·kg-1，速效钾197.5 mg·kg-1。

1.1.2 试剂与仪器 试验所用BCA总蛋白定量试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司；Bt蛋白定量检测试剂盒购于美国一龙公司。试验所用的仪器有酶标仪(μQuant)、人工气候箱(RXZ-600B)、低温震荡培养箱(BSD-250)、赛多利斯电子天平(BS124S)。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 实验室人工气候箱盆栽种植转基因抗虫棉，选择直径28 cm，高26.5 cm的塑料桶，底层放置厚约5 cm鹅卵石，上层装入混匀的试验土壤。人工气候箱温度37 ℃，光照16 h，黑暗8 h，光照强度66 %，湿度60 %。当幼苗生长到4～6叶期，分别进行以下处理：①对照：不经任何处理，充分灌水(CK)；②温度胁迫：低温(4 ℃)、高温(37 ℃)；③盐胁迫：0.1、0.2、0.5 mol·L-1NaCl；④水分胁迫：轻度干旱(土壤含水量为田间持水量的60～70 %)、中度干旱(土壤含水量为田间持水量的50 %～60 %)、重度干旱(土壤含水量为田间持水量的40 %～50 %)。参照李彦彬等[8]试验所用的方法进行水分梯度设置和控制土壤水分，每个处理设置3次重复，处理48 h后，取转基因抗虫棉的根、茎、叶-80 ℃冰箱冻存。

1.2.2 待测样品的处理 将采集的转Bt基因抗虫棉样品液氮研磨，每个样品研磨后迅速称取0.1 g粉末于离心管中，向离心管中加入1 mL的PBS溶液(由Envirologix试剂盒提供的提取缓冲液粉末溶解后再加5 %的吐温配置而成)，低温摇床振荡12 h，取出样品放于低温高速离心机4 ℃、8000 r/min离心20 min，取上清液备用。

1.2.3 可溶性总蛋白含量的检测 按照BCA 蛋白含量检测试剂盒要求稀释标准曲线，并稀释待测样品的可溶性总蛋白浓度至标准曲线范围内，将25 μl BSA标准液和待测样品分别加入到酶标板内相应位置，然后加入BCA 工作液200 μl，充分混匀37 ℃放置30 min后，在562 nm波长下读取光密度值，建立标准曲线并计算样品中可溶性总蛋白的含量。

1.2.4 Bt蛋白含量的检测 Bt 蛋白含量采用Envirologix试剂盒测定，按照试剂盒说明书，将标准蛋白稀释成1.00、0.80、0.64、0.46、0.28、0.10 ng·mL-16个浓度梯度，并稀释待测样品的Bt 蛋白浓度至标准曲线范围内，将标准液和待测样品一起加入酶标板内相应位置，得到相应的光密度值，建立标准曲线并计算样品中单位鲜重Bt 蛋白的含量。

1.3 数据处理

采用 Excel 2007和SPSS 13.0 软件进行数据处理和统计分析。

2 结果与分析

2.1 温度胁迫对转基因抗虫棉Bt蛋白含量的影响

对温度胁迫条件下转基因抗虫棉根、茎、叶中Bt蛋白含量进行测定(表1)，低温及高温胁迫导致Bt蛋白含量下降，高温下降幅度大于低温。根、茎中Bt蛋白含量下降较明显，均与CK差异显著，中棉45号叶中Bt蛋白含量呈下降趋势，与CK相比较无差异，鄂抗虫棉1号下降幅度大，与CK差异达显著水平。

表1 温度胁迫对转基因抗虫棉蛋白表达量的影响

2.2 盐胁迫对转基因抗虫棉Bt蛋白含量的影响

对盐胁迫条件下转基因抗虫棉根、茎、叶各组织的外源Bt蛋白含量进行测定(表2)，与CK相比较，在不同浓度的盐胁迫条件下，2个抗虫棉品种的根、茎、叶中Bt蛋白含量先不同程度的下降，在0.1或0.2 mol·L-1盐浓度处下降到最低，最低点Bt蛋白含量与CK差异达显著水平；在0.5 mol·L-1盐浓度胁迫条件下，Bt蛋白含量快速上升，其中鄂抗虫棉1号茎、叶中上升幅度最大，Bt蛋白含量高于CK，并与CK差异达显著水平。

2.3 水分胁迫对转基因抗虫棉Bt蛋白含量的影响

对水分胁迫条件下转基因抗虫棉根、茎、叶中Bt蛋白含量进行测定(表3)，不同程度水分胁迫下2个转基因抗虫棉根、茎、叶中，Bt蛋白含量变化趋势同盐胁迫大致相同。与CK相比较，在不同程度水分胁迫条件下，2个抗虫棉品种的根、茎、叶中Bt蛋白含量先不同程度的下降，在轻度干旱或中度干旱胁迫条件下最低，重度干旱胁迫条件下，Bt蛋白含量快速上升，其中鄂抗虫棉1号的根、茎中上升幅度最大，Bt蛋白含量高于CK，并与CK差异达显著水平。

表3 干旱胁迫对转基因抗虫棉蛋白表达量的影响

3 讨 论

非生物胁迫对转基因抗虫棉Bt蛋白表达量的影响已有较多报道，其中温度、盐、干旱胁迫是田间较常见的非生物胁迫因素。已有研究表明，37 ℃高温胁迫可导致Bt蛋白表达量下降，但温度胁迫对棉花生长后期的影响大于生长前期[9-10]。王永慧等[11]研究发现，温度和湿度双重胁迫可显著降低抗虫棉Bt蛋白含量，低温低湿度胁迫12 h后叶片Bt蛋白含量发生显著下降，而高温低湿度处理胁迫24 h后下降幅度较大。本试验研究发现，抗虫棉苗期温度胁迫48 h后，根、茎、叶中Bt蛋白含量发生显著下降，高温胁迫对Bt蛋白含量的影响大于低温胁迫。

土壤盐浓度直接影响抗虫棉Bt蛋白含量，张桂玲等[12]研究发现，10 d短期盐胁迫可导致抗虫棉根、茎、叶中的Bt蛋白含量、可溶性蛋白含量均降低，而从播种到四片真叶的长期盐胁迫可导致抗虫棉根、茎、叶中的Bt蛋白含量、可溶性蛋白含量均增加。代建龙等[13]研究发现，盐胁迫显著降低抗虫棉叶片中Bt蛋白含量，但盐胁迫条件下施氮肥可提高Bt蛋白含量。本试验研究发现，与CK相比较，0.1或0.2 mol·L-1NaCl的盐胁迫导致抗虫棉根、茎、叶中Bt蛋白含量不同程度降低，0.5 mol·L-1NaCl盐浓度胁迫处理后，Bt蛋白含量上升，在鄂抗虫棉1号的茎、叶中，Bt蛋白含量上升幅度较大，其测量值高于CK，与CK差异达显著水平。

水分过高或过低都不利于抗虫棉Bt蛋白的表达，周冬生等[14]对抗虫棉蕾期植株进行涝渍和干旱处理，旱涝处理1周后，取抗虫棉叶片和幼蕾进行生物测定，发现涝渍造成转Bt基因棉抗虫性的显著下降，而土壤干旱的影响则相对较小。王俊等[15]在抗虫棉盛蕾期和盛铃期进行5个梯度的水分胁迫处理，发现在抗虫棉蕾和铃壳中Bt蛋白含量随土壤含水量的下降而显著降低。本试验研究发现，与CK相比较，随干旱胁迫程度加重，抗虫棉根、茎、叶中Bt蛋白含量呈现先下降后上升的趋势，重度干旱胁迫条件下，鄂抗虫棉1号的根、茎中，Bt蛋白含量上升幅度较大，与CK差异达显著水平。

盐胁迫和水分胁迫都会导致植物细胞失水，2种非生物胁迫的分子机制都是通过外界信号诱导相关转录因子，调控下游抗性基因的表达以提高植物的抗逆性[16]。盐胁迫和水分胁都可以下调Bt蛋白的表达量，其分子机制还有待于进一步研究。本试验研究发现盐胁迫和干旱胁迫条件下，抗虫棉Bt蛋白表达量呈现先下降后上升的趋势，与前人的研究结果不一致，造成差异的试验结果可能有以下两个因素：①本试验设置的盐胁迫浓度和干旱程度范围大于之前的研究，胁迫时间也不相同。②在测量Bt蛋白含量时，称取相同质量的样品，由于0.5 mol·L-1盐浓度和重度干旱胁迫条件下，抗虫棉细胞严重失水，叶片萎蔫，称取样品量相对较大，因此造成0.5 mol·L-1盐浓度和重度干旱胁迫条件下Bt蛋白表达量上升的现象。

4 结 论

非生物胁迫对转基因抗虫棉Bt蛋白表达存在影响，温度、盐、干旱都会导致转基因抗虫棉Bt蛋白表达量下降，田间种植转基因抗虫棉要评估环境因子对抗虫棉抗性的影响，密切关注田间抗虫棉抗性的动态变化，在抗虫棉抗性下降田间虫害爆发初期及时排除环境因子的影响，降低害虫对棉花生产的危害。