姜黄素预处理缓解小鼠脓毒症心肌病的作用和机制研究

马榕祯，吴 岩，陈秀菊，黄 璠，左 茜，丁巧峰，白金金，陈鲁平，冯建宇

脓毒症是一种由感染引起的致命综合征，据报道在美国每年因脓毒症死亡人数达20万，其病理生理特征包括炎症反应、免疫功能障碍和凝血障碍等［1］。众所周知，免疫抑制是晚期脓毒症患者死亡的主要原因。此外，值得注意的是，脓毒症早期因炎症反应引起的感染性休克也是脓毒症患者死亡的重要原因［2］。脓毒症心肌病是因病原体感染引起的心肌病变，严重者可导致心衰、心律失常和心源性休克等。一项回顾性队列研究报道，脓毒症心肌病在脓毒症和败血症性休克患者中发生率约为13.8%，且与脓毒症患者预后密切相关［3］。因此，寻找有效心肌保护药物减轻脓毒症心肌病对于改善脓毒症患者预后具有非常重要的临床意义。

姜黄素（Curcumin，Cur），又称为 1，7-双（4-羟基-3-甲氧基苯基）-1，6-庚二烯-3，5-二酮，是姜黄根茎中最主要的多酚成分，是治疗咳嗽、鼻窦炎、哮喘、腹痛、风湿病、糖尿病等疾病传统中药的主要成分之一［4］。近些年来，Cur的心肌保护作用也越来越受到重视。Cur可减轻多柔比星引起的心脏毒性［5］、异丙肾上腺素诱导的心肌缺血和纤维化［6］、压力负荷引起的心肌肥厚和慢性心肌衰竭［7］、糖尿病引起的心肌纤维化反应［8］等。此外，也有研究表明，Cur能减轻脂多糖和盲肠结扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP） 诱导的脓毒症心肌损害［9-10］。但是Cur抵抗脓毒症心肌损害的具体分子机制尚未完全阐明。沉默信息调控因子1（silent information regulator 1，SIRT1）是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD＋）依赖的具有组蛋白去乙酰化酶活性的转录调节因子［11］。以往研究发现，SIRT1是介导Cur心肌保护作用的关键性下游分子［12-13］。据此，笔者推测Cur可能通过激活SIRT1信号通路改善脓毒症引起的心肌损伤。

1 材料与方法

1.1 实验动物 ①8～10 周龄 C57BL／6 小鼠（SPF级）购买自空军军医大学实验动物中心。动物饲养于室温环境，给予自由饮食饮水。②主要试剂。Cur（货号：C1386）和 SIRT1特异性抑制剂 Sirtinol（货号：S7942）购买自Sigma公司（美国）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、丙二醛（ma⁃londialdehyde，MDA）含量、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性检测试剂盒购买自南京建成生物工程研究所（中国）；抗SIRT1（货号：ab110304）和 Ac-p53（货号：ab61241）抗体购买自Abcam 公司（美国）；抗 Bax（货号：2772）、Bcl-2（货号：3498）、Caspase 3（货号：9662）和 β-actin（货号：58169）抗体购买自CST公司（美国）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型的建立 通过CLP法建立脓毒症小鼠模型。具体建模方法参照Yu等［14］所述方案。简言之，采用腹部小切口，在盲肠末端1 cm处用2-0丝线结扎盲肠，然后用23号针穿刺两次。向腹腔内挤压少量粪便。然后用3-0丝线缝合腹部切口。假手术小鼠进行相同处理，但不进行CLP。

1.2.2 实验分组及给药方式 实验小鼠随机分组如下：假手术组（Sham组，n＝15）：小鼠假手术前3 d每日通过灌胃给予生理盐水（0.2 ml），共灌胃3 d，随后进行假手术处理；Cur预处理组（Cur组，n＝15）：小鼠假手术前3 d每日通过灌胃给予Cur（100 mg／kg），共灌胃3 d天，随后进行假手术处理；CLP组（CLP组，n＝15）：小鼠CLP前3 d每日通过灌胃给予生理盐水（0.2 ml），共灌胃 3 d，随后进行 CLP；Cur预处理＋CLP 组（Cur＋CLP 组，n＝15）：小鼠 CLP前3 d每日通过灌胃给予 Cur（100 mg／kg），共灌胃3 d，随后进行 CLP；Sirtinol预处理＋Cur预处理＋CLP组（Sirtinol＋Cur＋CLP 组，n＝15）：小鼠CLP 前3 d每日给予 Cur（灌胃，100 mg／kg）和 Sirtinol（腹腔注射，5 mg／kg），共处理 3 d，随后进行 CLP；Sirtinol预处理＋CLP 组（Sirtinol＋CLP 组，n＝15）：小鼠 CLP 前 3 d每日给予 Sirtinol（腹腔注射，5 mg／kg），共处理 3 d，随后进行CLP。

1.2.3 心肌收缩舒张功能检测 CLP手术后48 h，通过 Millar导管技术（SPR-839，Millar Instruments公司）检测心脏收缩与舒张功能。简而言之，腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg／kg）麻醉小鼠，并用小动物呼吸机（Minivent，Harvard Apparatus公司）辅助呼吸，潮气量为 0.1～0.2 ml，呼吸频率为 110～120 次／min。颈部正中切开皮肤，分离右颈总动脉，将1.4 Fr软导管从右颈总动脉逆行插入左心室以测量心脏功能。用 PVAN 3.4软件（Millar Instruments公司）计算左心室内压最大上升速率（＋dp／dtmax）和左心室内压最大下降速率（-dp／dtmax）。心脏功能分析完成后，取出心脏并用预冷的PBS清洗心脏2 min以除去剩余的血液。部分心脏组织固定于10%福尔马林以备TUNEL染色，部分心脏储藏在-80℃冰箱以备蛋白表达以及氧化应激损伤指标检测。

1.2.4 心肌组织凋亡率检测 将固定于10%福尔马林中的心脏组织经过脱水、透明、浸蜡、包埋处理后，固定于切片机上，切成5 μm厚的石蜡切片。石蜡切片再经脱蜡、至水后，根据试剂盒说明书，通过原位末端转移酶标记（TUNEL）技术检测心肌组织石蜡切片中的凋亡细胞。使用荧光显微镜拍照后计算心肌细胞凋亡率。

1.2.5 心肌组织氧化应激指标检测 从-80℃冰箱内取出心脏组织，并匀浆为1／10浓度的组织蛋白液。根据试剂盒说明书所述步骤，分别检测MDA含量、SOD和GSH-Px活性。

1.2.6 Western Blotting 检测 SIRT1 信号通路和凋亡关键蛋白表达情况 将心肌组织匀浆后提取蛋白，然后煮沸10 min以使蛋白质变性。将蛋白样品用12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）进行电泳，然后在200 mA恒流条件下将蛋白质转移2 h至硝酸纤维素膜上。将硝酸纤维素膜在室温下用5%脱脂奶粉封闭1 h后，在 4℃下孵育抗SIRT1、Ac-p53、Bax、Bcl-2、Caspase 3 和 β-actin 抗体过夜。然后，将硝酸纤维素膜与二抗在室温下孵育1 h，并用ECL化学发光液显示蛋白条带。使用Image J图像分析系统（NIH，美国）半定量蛋白表达情况。β-actin作为Western Blotting内参。

1.7 统计分析 统计分析软件为Graphpad prism 5，所有定量数据均以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析对两组以上的实验数据进行统计分析，两组间比较用 LSD-t检验。P＜0.05被认为有统计学意义。

2 结 果

2.1 Cur预处理改善脓毒症引起的小鼠心脏收缩舒张功能障碍 如图1A所示，与Sham组相比，CLP组小鼠＋dp／dtmax明显降低，提示脓毒症小鼠心肌收缩功能明显受损（P＜0.05）。与CLP组小鼠相比，Cur预处理可以明显提高＋dp／dtmax，提示Cur可以明显改善脓毒症小鼠心肌收缩功能（P＜0.05）。如图1B所示，与Sham组相比，CLP组小鼠-dp／dtmax明显降低，提示脓毒症小鼠心肌舒张功能也明显受损（P＜0.05）。 与CLP组小鼠相比，Cur预处理可以明显提高-dp／dtmax，提示Cur可明显改善脓毒症小鼠心肌舒张功能（P＜0.05）。与Sham组相比，单纯给予 Cur预处理对于＋dp／dtmax和-dp／dtmax和均无明显影响，即Cur不影响正常小鼠的心肌收缩与舒张功能（P＞0.05）。

2.2 Cur预处理明显减轻脓毒症引起的小鼠心脏氧化应激损伤 与Sham组小鼠相比，CLP组小鼠心肌组织内脂质过氧化产物MDA含量明显增加，而心肌抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性明显降低（P＜0.05）。与CLP组相比，Cur预处理可以明显降低心肌组织MDA含量，提高SOD和GSH-Px活性（P＜0.05）。单纯给予正常小鼠Cur不影响心肌组织MDA含量以及SOD和 GSH-Px活性（P＞0.05，见图1 C～E）。

2.3 Cur预处理抑制脓毒症引起的小鼠心肌凋亡与Sham组小鼠相比，CLP组小鼠心肌凋亡率、Bax和Caspase 3的表达水平明显增加，而心肌Bcl-2的表达水平明显降低（P＜0.05）。与CLP组相比，Cur预处理可以明显降低心肌凋亡率、Bax和Caspase 3的表达水平，提高 Bcl-2的表达水平（P＜0.05）。单纯给予正常小鼠Cur不影响心肌组织凋亡率、Bax、Bcl-2和 Caspase 3的表达水平（P＞0.05，见图1 F～J）。

2.4 Cur预处理激活脓毒症小鼠心肌组织SIRT1信号通路 与Sham组小鼠相比，CLP组小鼠心肌SIRT1的表达量明显降低，而SIRT1下游分子p53的乙酰化水平明显增加（P＜0.05）。与CLP组相比，Cur预处理可以明显提高心肌SIRT1的表达量，降低Ac-p53的表达量（P＜0.05）。单纯给予正常小鼠Cur对心肌组织SIRT1和Ac-p53的表达水平无显著影响（P＞0.05，见图1 K～L）。

2.5 Sirtinol减弱Cur对脓毒症小鼠心脏功能的保护作用 与 Cur＋CLP 组相比，Sirtinol＋Cur＋CLP 组小鼠＋dp／dtmax和-dp／dtmax均明显降低，即 Sirtinol可以减弱Cur对脓毒症小鼠心脏收缩和舒张功能的保护作用（P＜0.05）。 与 CLP 组相比，给予 Sirtinol预处理对于＋dp／dtmax和-dp／dtmax均无明显影响，即Sirtinol不影响脓毒症小鼠的心肌收缩与舒张功能（P＞0.05，见图 2 A～B）。

2.6 Sirtinol减弱Cur抗氧化应激损伤和抗凋亡作用 与 Cur＋CLP 组相比，Sirtinol＋Cur＋CLP 组小鼠心肌MDA含量明显增加，而SOD和GSH-Px的活性明显降低（P＜0.05）。 此外，与 Cur＋CLP 组相比，Sirtinol＋Cur＋CLP组小鼠心肌凋亡率、Bax和Caspase 3的表达水平明显增加，而心肌Bcl-2的表达水平明显降低（P＜0.05）。与CLP组相比，单纯给予Sirtinol预处理对于MDA含量、SOD和GSHPx活性、凋亡率、Bax、Bcl-2和Caspase 3的表达水平均无明显影响（P＞0.05，见图2 C～J）。

3 讨 论

脓毒症的主要致命后果之一是心脏功能出现障碍［15］，因此脓毒症患者生存的重要预测因素之一是心肌功能障碍的恢复情况［16］。在该研究中，笔者发现CLP诱导的脓毒症对动物心脏收缩与舒张功能均造成严重损伤，表现为＋dP／dtmax和-dP／dtmax明显降低。脓毒症发生前给予Cur可通过减少心肌组织氧化应激损伤和抑制细胞凋亡来预防脓毒症诱发的心功能障碍。此外，Cur预处理可以明显增强心肌中SIRT1的表达和活性，而抑制SIRT1信号通路可以明显减弱Cur的心肌保护作用。

图1 Cur预处理对脓毒症小鼠心脏功能、氧化应激、凋亡以及SIRT1信号通路的影响

Cur是在姜黄中发现的一种膳食多酚，近年来，越来越多的证据显示Cur是一种重要的心肌保护药物。Zhang等［5］发现，给予荷瘤小鼠 Cur与多柔比星共处理，一方面可以增加多柔比星的抗肿瘤效果，另一方面也可减轻多柔比星引起的心脏毒性。Al⁃lawadhi等［6］证实，Cur处理可以明显减轻异丙肾上腺素诱导的心脏毒性、心肌缺血和心脏纤维化。Liu等［17］发现，Cur可以通过抑制炎症反应改善心肌缺血再灌注损伤。此外，Cur对于脓毒症引起的心肌损害也发挥了保护作用［9-10］，但具体机制尚未完全阐明。

脓毒症患者心肌细胞线粒体超微结构明显受损，出现线粒体功能障碍。线粒体功能障碍在脓毒症的发病中起重要作用，且其程度与脓毒症的预后密切相关［18］。当线粒体功能障碍持续时，心肌细胞将产生过量ROS，而ROS诱导的氧化应激继而引起线粒体损伤，加剧线粒体功能障碍［19］。近年来，越来越多证据显示应用抗氧化剂可以预防线粒体异常，改善脓毒症心功能障碍并降低死亡率。Huang等［20］证实，丹参酮IIA通过抑制烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶2相关信号通路减轻内毒素诱导的脓毒症小鼠的心功能障碍。Chen等［21］发现，红景天甙治疗可以通过调节ROS的产生减轻脓毒症引起的炎症反应，从而改善脂多糖引起的心脏功能障碍。Cur是一种重要的天然抗氧化剂，其抗氧化应激作用主要表现为：①上调内源性抗氧化途径，包括SOD、GSH-Px和过氧化氢酶等；②抑制ROS的产生，消除ROS，减少脂质过氧化产物MDA含量；③改善线粒体功能，特别是维持线粒体氧化还原电位［13，22］。 与此一致的是，在该研究中，笔者发现，Cur可明显增强脓毒症小鼠心肌抗氧化酶SOD和GSH-Px活性。相反，Cur明显降低氧化应激标记物MDA的含量。以往研究证实，线粒体功能障碍和ROS产量的增加可以通过激活线粒体途径凋亡信号通路，进而引起心肌细胞发生凋亡，损害心脏功能［23］。而抑制凋亡途径的激活也是减轻脓毒症心肌损伤的重要方式［24］。该研究证实，Cur预处理可以明显降低脓毒症小鼠心肌凋亡率以及促凋亡蛋白Bax和Caspase 3的表达水平，提高抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平。以上结果说明，Cur可通过抑制心肌氧化应激损伤和凋亡改善脓毒症引起的心肌损害。

图2 SIRT1特异性抑制剂Sirtinol预处理对脓毒症小鼠心脏功能、氧化应激和凋亡的影响

SIRT1是NAD＋依赖的具有组蛋白去乙酰化酶活性的转录调节因子，通过去乙酰化多种靶蛋白，参与调节细胞增殖、分化和衰老等多种生理病理过程［25］。近年来研究发现，SIRT1信号通路受损是介导脓毒症心肌损害的关键机制之一，而激活SIRT1信号通路有望成为脓毒症心肌损伤防治的重要策略。 Han 等［26］发现与野生型小鼠相比，SIRT1-／-小鼠CLP后，死亡率明显增加，心肌损伤明显加重。而用T0901317激活SIRT1信号通路后，心肌炎性分子表达、氧化应激损伤、内质网应激和凋亡均受到明显抑制。Hong等［27］证实，烟酰胺核糖可以通过激活SIRT1信号通路抑制心脏组织中氧化应激损伤、炎症和Caspase 3活性，从而改善脂多糖引起的心肌损伤。该研究中笔者发现，与Sham组相比，CLP组小鼠心肌SIRT1信号通路明显受损。而Cur预处理可以激活脓毒症小鼠心肌SIRT1信号通路。用Sirtinol抑制SIRT1信号通路后，Cur改善心脏功能障碍、氧化应激损伤和凋亡的作用均明显减弱。

综上所述，Cur预处理可以通过激活SIRT1信号通路抑制心肌组织氧化应激损伤和凋亡，改善脓毒症引起的心肌损害。该研究对于促进Cur在脓毒症心肌病防治方面的临床应用提供了新的理论依据。