灌胃刺激对B16细胞株HSV-tk/GCV系统基因治疗及缝隙连接蛋白表达的影响

易华，郭玉荣，苏俊芳，吴绍峰，李雪，杜标炎

（1广州中医药大学基础医学院，广东 广州；2柳州市中医院，广西 柳州）

0 引言

前期系列研究证实，六味地黄丸含药血清可以增加对恶性黑色素瘤B16细胞自杀基因系统的作用效果[1,2]，其机制与缝隙连接机制有关[3-5]。在实验研究过程中，课题组发现对照组血清也能够提高Cx26的表达。这到底是灌胃刺激还是鼠血清本身起到的作用？该作用能否影响B16细胞株HSV-tk/GCV自杀系统的治疗效果？本研究通过选用不同途径制备的三种血清，观察它们对HSV-tk/GCV自杀系统的治疗效果及缝隙连接蛋白Cx26、Cx43表达的影响。

1 材料

1.1 细胞

小鼠恶性黑色素瘤细胞株B16从中山大学动物中心细胞库购入，B16/tk为本实验室进行构建保存。

1.2 试剂与耗材

细胞培养用RPMI-1640粉和0.25%含EDTA胰酶的生产厂商为Gibco公司；BCA蛋白质定量检测试剂盒、脱脂奶粉分别来自于上海申能博采生物科技有限公司、内蒙古伊利股份有限公司；新生牛血清来自于奥地利PAA公司；蛋白marker（cat No.SM0431,Lot No.00023933）来自于Fermentas公司；青、链霉素合剂的生产厂商是杭州吉诺生物医药技术有限公司；异丙醇的生产企业为广东新宁化工厂；过硫酸铵（AP）、二甲基亚砜（DMSO）、甘氨酸、丙烯酰胺、SDS、Tris、β-巯基乙醇、PMSF由Sigma公司生产；抗体稀释液、5% BSA、一抗兔抗鼠Cx43多克隆抗体、一抗兔抗鼠Cx26多克隆抗体（cat No.BA1591）、一抗小鼠抗鼠β-actin多克隆抗体（cat No.BM0627）的生产企业都是武汉博士德生物工程有限公司；HRP标记的山羊抗兔二抗（cat No.ZB-2307,Lot No.77928）和山羊抗小鼠二抗（cat No.ZB-2305,Lot No.78039）是由中杉金桥生物技术有限公司生产的；RNA提取试剂盒TRIzol reagent为Invitrign公司产品；First Strand cDNA Synthesis Kit购于TOYOBO公司；用于进行细胞培养的培养板、培养皿、培养瓶、冻存管的生产厂商都是德国Greiner bio-one公司；一次性微孔滤膜来自于美国的Corning公司。

1.3 仪器

日本ESPEC产品BNA-3210型CO2培养箱；苏州净化设备厂生产的JH型超净工作台；江苏省海门其林医用仪器厂生产的型号为QL-190的旋涡混合器；重庆COIC产品XDS-1B型倒置显微镜；PowerPac 300型电泳仪、Gen Doc 1000型凝胶成像系统均为美国Bio-Rad产品；来自于哈尔滨市东联电子技术开发有限公司的型号为HZQ-C的空气浴震荡器；超级微量恒温器的型号为HW-8B型，生产厂商为上海浦江分析仪器厂；稳流稳压电流系统型号为DYY-8C型，来自于Bio-Rad公司；SDS－PAGE蛋白垂直电泳系统和转膜系统（Bio-Rad公司，20型）；日本Bio-Rad的630型酶标仪；脱色摇床型号为TY-80B，来自于南京大学；YX280B型不锈钢蒸汽消毒器生产厂商为上海三申医疗器械有限公司；CSY12-R120-W型纯水器来自于韩国Human Corp；电热恒温干燥箱的型号是400型，产自长沙医疗器械厂；JB-1型磁力搅拌器来自于上海雷磁仪器厂新泾分厂；电动离心机型号为XYJ-801，来自于江苏省金坛市医疗仪器厂；液氮器由四川省乐山市东亚机电工贸有限公司生产，型号为YDS-30；日本岛津HZ211-220型电子天平；细胞计数板为上海求精生化试剂仪器有限公司生产的，型号为XB-K-25；pH计型号为HI4212，来自于意大利HANNA。

2 方法

2.1 血清的制备

新生牛血清从奥地利PAA公司购入。无灌胃刺激鼠血清：用3%戊巴比妥钠将SD大鼠（200-220g，雄性，健康，SPF级）麻醉后，腹主动脉取血。将离心管中的全血室温静置3h，以每分钟3000转的转速进行15min的离心处理，分离血清后，放入到56℃的水浴箱中进行灭活，时间为30min；用细胞室内0.2μm滤膜进行过滤分装；保存在-70℃冰箱中备用。灌胃鼠血清：用蒸馏水对SD大鼠进行灌胃处理，腹主动脉取血。

2.2 无灌胃刺激鼠血清对B16细胞株HSV-tk/GCV系统治疗的影响

分别消化B16，B16/tk细胞，然后将细胞密度为2×104个/ml的细胞悬液，将两种细胞混合，使B16/tk的数量为占总细胞数目的20%。使用96孔板对其进行接种，每孔中加入100μl细胞悬液（2×103个/孔），设定5%CO2培养箱温度为37℃，进行24h的培养，然后换新鲜的无血清培养基，设置如下组别：即新生牛血清组、新生牛血清联合GCV组、无灌胃刺激鼠血清组、无灌胃刺激鼠血清联合GCV组、灌胃鼠血清组、灌胃鼠血清联合GCV组，以上组别中GCV均为20μm的作用浓度，将96孔板放置在5% CO2培养箱中，在37℃条件下进行48h的培养，然后采用MTT法进行检测，进行细胞存活率的计算。

2.3 RT-PCR法检测无灌胃刺激鼠血清对B16细胞株Cx26、Cx43mRNA表达水平的影响

设置新生牛血清组、灌胃鼠血清组、无灌胃刺激鼠血清组。培养细胞，药物作用48h后。各组细胞样品应用试剂盒提取RNA。cDNA合成25μl体系中含：RNA-Primer Mix（13μl），5×缓冲液5μl，dNTPs（25mM）1μl，100ng随机引物，M-MLV(200U/μl)1μl,加DEPC水 至25μl。逆转录条件为：42℃ 60min,99℃ 5 min。各取RT产物10μl,进行PCR扩增，0.2g·L-1琼脂糖凝胶观察结果。

2.4 Western Blot法检测无灌胃刺激鼠血清对B16细胞株Cx26、Cx43蛋白表达水平的影响

设置新生牛血清组，无灌胃刺激鼠血清组，灌胃鼠血清组。培养细胞，药物作用48h后弃去培养基，PBS缓冲液洗三遍，每孔加入150μLRipa裂解液进行裂解，然后使用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量操作，使用Ripa配置成相同浓度的蛋白溶液，-80℃保存。每组取20μl蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，之后通过转膜装置将蛋白向PVDF膜上进行转移，使用5%脱脂牛奶室温摇床封闭1h，Cx43、Cx26一抗4℃孵育过夜，TBST洗涤3次，每次5min，二抗孵育2h，洗涤3次每次5min，使用HRP发光液进行显影操作，得到结果后使用Gel-pro软件进行灰度值分析。

3 结果

3.1 无灌胃刺激鼠血清对B16细胞株HSV-tk/GCV系统治疗的影响

使用倒置显微镜进行镜下观察，各组中的细胞形态、细胞数目在用药前差异均很小；无灌胃刺激鼠血清组、灌胃鼠血清组的细胞生长情况较好，有明显的增殖现象，相比于新生牛血清组，差异不明显。三种血清联合GCV组中，均有细胞数目减少、密度变小的情况出现，一些细胞有变圆、脱落的情况。MTT检测细胞存活率情况见图1：新生牛血清组、无灌胃鼠血清组、灌胃鼠血清组分别为：（10 0±10.39）%、（101.77±8.53）%、（95.72±7.58）%，加GCV后以上三组细胞存活率分别为：（64.28±4.40）%、（67.42±4.42）%、（64.61±6.96）%，新生牛血清组作为对照，另外两组血清对B16细胞存活率差异不大，三种血清分别联合GCV则会明显抑制B16细胞（P＜0.01）。以新生牛血清联合GCV组作为对照，无灌胃刺激鼠血清、灌胃鼠血清联合GCV组对B16细胞的存活率差异不大（P＞0.05）。该结果说明本研究的三种血清对B16细胞的生长以及HSV-tk/GCV自杀基因系统治疗的效果比较一致。

3.2 无灌胃刺激鼠血清对B16细胞株Cx26、Cx43 mRNA表达的影响

培养B16细胞，分别用新生牛血清、无灌胃刺激鼠血清、灌胃鼠血清三种血清作用48h，实时荧光定量PCR测定Cx26和Cx43 mRNA的表达，结果如图2所示：对照组为新生牛血清组，进行Cx26 mRNA表达条带变化的观察，灌胃鼠血清组宽度增加明显，无灌胃刺激鼠血清组变化不明显，而在Cx43 mRNA表达条带方面，两组均无明显变化。使用Imagepro-plus 5.1软件分析各条带的光密度值，进行Cx26 mRNA、Cx43 mRNA相对表达量的计算，结果见表1、表2。结果表明：灌胃处理后的鼠血清会促使B16细胞中Cx26 mRNA的表达升高，但不影响Cx43 mRNA表达，无灌胃刺激的鼠血清不会影响B16细胞中Cx26和Cx43 mRNA的表达。

图1 自杀基因系统联合血清对B16细胞株的杀伤效应(MTT)

图2 各组细胞Cx26和Cx43 mRNA表达电泳图

表1 血清对B16细胞株Cx26表达的影响

表2 血清对B16细胞株Cx43表达的影响

3.3 无灌胃刺激鼠血清对B16细胞株Cx26和Cx43蛋白表达情况的影响

培养B16细胞，分别用新生牛血清、无灌胃刺激鼠血清、灌胃鼠血清三种血清作用48h，Western Blot检测Cx26、Cx43 蛋白表达情况，结果如图3所示：以新生牛血清为对照，在Cx26蛋白表达条带的变化方面，灌胃鼠血清组宽度出现明显增加，无灌胃刺激鼠血清组未出现明显改变；在Cx43蛋白的表达方面，无灌胃刺激鼠血清组、灌胃鼠血清组变化均不明显。用Imagepro-plus 5.1软件分析各条带灰度值，计算Cx26和Cx43蛋白的相对表达量，结果如表3。结果表明：灌胃刺激后鼠血清可使B16细胞Cx26蛋白的表达量增加，但不影响Cx43蛋白的表达，而无灌胃刺激的鼠血清对以上两种蛋白表达均无明显影响。

图3 各组细胞Cx26和Cx43表达蛋白印迹图

表3 血清对B16细胞株Cx26，Cx43表达的影响（免疫印迹）

4 讨论

血清药理学为中药研究中使用的新型实验技术，可以防止中药制剂理化性质干扰体外实验，目前已经有大量的中医药学研究通过此方法进行开展[6-9]。血清药理学在药理研究中具有不可替代的作用，但是其方法、应用仍存在不少问题。血清的成分具有复杂性，同时，血清在制备过程中，不同的物种、给药方式、给药时间等均可影响血清质量[10-13]。有实验研究指出，冷刺激可下调心肌细胞Cx43、使肾上腺嗜酪细胞Cx表达增加，但尚未发现对肿瘤细胞Cx表达影响方面的报道[14，15]。本课题在进行六味地黄丸含药血清联合自杀基因治疗肿瘤的相关研究过程中，也发现对照血清也可提高缝隙连接蛋白Cx26的表达。鉴于此，本实验将考虑血清种属，探讨血清药理学中的灌胃给药对旁观者效应的影响。

本实验以新生牛血清与鼠血清做对比，研究在血清制备过程中的灌胃刺激是否会促进大鼠机体内某些非药物物质的分泌，从而影响缝隙连接蛋白Cx的表达。实验结果显示，新生牛血清、无灌胃刺激鼠血清及灌胃鼠血清对恶性黑色素瘤B16细胞HSV-tk/GCV系统基因治疗效果及Cx43的表达无显著差异，但灌胃鼠血清能够提高Cx26的表达。研究结果表明，灌胃刺激能促使机体产生某种活性物质，这种活性物质对于恶性黑色素瘤B16细胞HSVtk/GCV系统的杀伤效果无影响，但会对其B16细胞Cx26表达产生影响，还有待深入研究其作用机制。