干细胞ECM修复软骨缺损与鹿茸干细胞ECM的研究进展

王玉俗，褚文辉，李久波，赵全民※，李春义

（1.吉林农业大学中药材学院，吉林 长春 130118；2.台州学院生命科学学院，浙江 台州 317000；3.长春市农业机械研究院，吉林 长春 130000；4.中国农业科学院特产研究所特种经济动物分子生物学国家重点实验室，吉林 长春 130112）

透明软骨是软骨的主要类型之一，由软骨细胞及细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）所构成[1]。关节表面软骨层软骨细胞的主要营养来源是关节液，由于内无血管，只能靠细胞基质渗透完成，再加上软骨细胞缺乏迁移能力，不能聚集到创伤部位，因此，关节表面软骨损伤后自身修复能力受到极大的限制。在关节滑膜有病变时，如机械损伤导致的骨关节炎，关节软骨出现破损；类风湿性关节炎，滑液分泌异常失去正常的润滑作用，摩擦力增大导致软骨缺损[2]。长期的软骨缺损使破损面逐步加大，最终的治疗方式为人工关节置换。研究表明，美国每年因关节炎接受关节置换手术的患者已经超过140 万。我国估计每年接受关节置换的患者约为45 万[3-4]。因此，旨在减少骨性关节炎发生，大量的软骨修复研究意义重大。

随着人工合成材料和纳米材料的兴起，种子细胞结合支架材料为软骨缺损修复开辟了新时代[5-6]。研究表明，猪软骨细胞的细胞外基质和聚羟基乙酸（Polyglycolic acids,PGA）支架植入裸鼠皮下可构建软骨组织。试验表明，软骨细胞在ECM 中的增殖，黏多糖（Glycosaminoglycan，GAG）和胶原的沉积明显高于PGA，且均匀地分布在ECM支架中，PGA支架主要在支架外周区域有沉积[7]。表明ECM 为软骨形成提供了有利环境。天然支架ECM 具有高组织相容性并且具有保留细胞因子、生长因子和其他功能性蛋白质的潜力。

鹿茸组织是一种骨/软骨复合物，其软骨组织中富含血管、多种骨/软骨生成相关因子[8]，是一种良好的软骨修复材料。但鹿茸价格昂贵，使用鹿茸组织ECM修复软骨缺损不是最佳的选择。李春义等[9]研究表明，鹿茸的发生是由鹿茸干细胞分裂、分化而实现，即生茸区骨膜（Anterogenic periosteum，AP）分化为角柄，再由角柄骨膜（Pedicle periosteum，PP）再生出鹿茸。鹿茸干细胞具有分化出完整的骨、软骨组织器官的能力，将鹿茸干细胞进行体外培养，收集其分泌的ECM，从理论上，ECM可能是软骨修复的一个新的天然生物支架材料。本文就软骨缺陷修复进行综述，并对使用鹿茸干细胞ECM 修复软骨缺陷的初步结果进行总结。

1 软骨的结构特征

软骨主要作用包括承受力学负荷，关节软骨能将作用力均匀分布，使承重面扩大，保护关节不易损伤；润滑作用，关节软骨表面光滑，因此关节运动时不易磨损[10]两个方面。软骨是由软骨细胞和ECM 组成，其中，ECM约占总体积的98%，其主要由水、蛋白多糖和胶原组成。胶原的主要成分为Ⅱ型胶原，在软骨内形成网架结构维持形态和硬度[11]。胶原网架结构内由蛋白多糖填充，蛋白多糖中大量带负电的阴离子如COO-和SO32-相互排斥并吸引阳离子，从而产生渗透压，使水进入软骨内[12]。硫酸软骨素等吸附流动的水产生摩擦阻力，软骨承受压力后引起水在多孔固态基质内流动，使水起到承重的作用。软骨细胞是一种高度分化的细胞，存在于软骨陷窝，约占总体积的1%[13]。软骨中软骨基质蛋白的合成和分泌主要来源于软骨细胞。成年人的软骨细胞在正常状态下不会发生分裂，但当软骨在受到病理刺激后会发生增殖。胶原纤维与基质共同作用使软骨具有弹性和张力及强度。胶原纤维类似混凝土中的钢筋，其他基质类似混凝土中的水泥。由于软骨具有这种富含基质的组织学特征，软骨基质受到破坏就意味着软骨的缺损。

2 间充质干细胞修复软骨缺损

间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）是组织工程方法中常用的细胞。这些细胞具有较高的增殖率和软骨分化能力，容易从脂肪组织、骨髓和滑膜中收集[14-15]。据报道，植入的干细胞会释放生长因子、生物活性脂质和细胞因子，这些因子具有促进软骨再生和抗炎作用[16-18]。常用于治疗软骨缺损的干细胞有骨髓间充质干细胞（BMSCs）和脂肪干细胞（ADSCs）等。

2.1 骨髓间充质干细胞修复软骨缺损

骨髓间充质干细胞（Bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是组织工程中研究最多的干细胞，不同的研究均报道了这些细胞治疗软骨缺损的潜力，并已经在临床I 期和II 期中得到应用[19]。Wakitani 等[20]在40 名膝关节缺损患者中使用BMSCs 修复，并对患者进行11年的随访和观察，临床治疗效果表明，关节缺损得到修复并且在观察期间未出现肿瘤或发生感染。证明BMSCs 移植是安全有效的治疗方法。Gobbi 等[21]对37 例关节软骨缺损患者进行治疗，其中19 例使用自体软骨移植治疗，18 例使用自体BMSCs 治疗。结果表明，5年后自体软骨移植和BMSCs的治疗成功率分别为76%和81%，再生软骨都为透明软骨。

2.2 脂肪干细胞修复软骨缺损

脂肪干细胞（Adipose-derived stem cells，ADSCs）由于其易获取，并具有与BMSCs 相同的特性，被认为是修复软骨缺损中BMSCs 的良好替代品[22]。研究表明，ADSCs可产生多种有益的旁分泌因子降低关节软骨中肿瘤坏死因子（TNF-）和基质金属蛋白酶（MMP）的产生，增强软骨保护作用[23-24]。Yong-Gon 等[25]对18 名关节缺损患者关节内注射ADSCs，2年后随访发现患者软骨缺损得到改善、疼痛感减轻和膝关节功能得到改善。

3 ECM修复软骨缺损

ECM 是活体组织和器官内细胞分泌的细胞外产物，其作为细胞生长的微环境，在细胞黏附、增殖和分化方面都起着重要作用。ECM 主要由胶原蛋白、蛋白聚糖与氨基酸聚糖等多种大分子组成的复杂网络结构[26-27]。ECM 在不同的组织器官中主要成分含量不同。如胶原蛋白种类众多，其中Ⅱ型胶原蛋白主要由软骨细胞产生的，多存在于骨骼、关节、肌腱等组织中，Ⅱ型胶原比Ⅰ、Ⅲ型胶原含有更丰富的羟脯氨酸，更适合对软骨修复。Wang 等[28]将从兔和大鼠肌腱和尾部获得的II 型和I 型胶原混合制成支架，并将兔软骨细胞与兔胶原支架和大鼠胶原支架混合植入经手术创建的缺损兔膝关节软骨中，结果表明，修复的软骨细胞均明显地成簇排列，修复软骨与邻近的健康组织整合良好。ECM 具有支持组织形态形成，并且为免疫应答提供场所的功能，其在机体生长发育过程中起到重要作用。ECM 支架具有高组织相容性并且具有保留细胞因子（Cytokine,CK）、生长因子和其他功能性蛋白质的潜力。Schwarz等[29]将软骨组织脱细胞得到ECM支架后对软骨缺损处进行修复，结果显示，ECM 支架在促进新生软骨基质合成方面具有明显优势。猪小肠黏膜下层（Porcine small intestinal submucosa，SIS）-ECM已被用于重建各种组织，并且取得了良好的临床效果[30]。但目前的组织ECM 制备过程繁琐，不适合临床应用。

在抗坏血酸的作用下，干细胞可分泌大量的胶原，形成细胞膜片即ECM。体外试验证明，软骨细胞通过细胞培养所得的ECM 支架能够促进细胞增殖，并且可以促进组织再生[31]。细胞ECM 支架形成的过程通常分三步：第一步，单层培养细胞至80%～90%；第二步，添加抗坏血酸促进ECM沉积；第三步，收集ECM，去细胞化，得到ECM 支架。ECM 支架材料，不但能作为生物支架为细胞的进入提供支撑，而且还保留了原组织中生长因子，移植到活体后组织会做出自然应答。在生物支架材料软骨修复过程中，一些重要的生长因子，如转化生长因子（Transforming growth factor,TGF）、成纤维细胞生长因子（Fibroblast growth factor,FGF）和表皮生长因子（Epidermal growth factor，EGF）如能保留，可以增强软骨细胞的功能并促进软骨细胞再生[26]。Tang 等[32]使用 BMSCs-ECM 对兔膝关节软骨缺损进行治疗，结果表明，ECM 可以使BMSCs 促进缺损部位细胞增殖，在软骨分化和基质生成中发挥重要作用。因此，干细胞ECM 支架制备不仅简单，而且可以更好地使细胞附着，有可能成为临床上具有广阔前景的软骨修复材料。

4 鹿茸干细胞ECM的初步研究和应用前景

4.1 鹿茸的再生与鹿茸干细胞

鹿茸作为唯一能够完全再生的哺乳动物附属器官，可以作为众多再生研究的理想模型，同时也为我们揭示自然界哺乳动物复杂器官完全再生的问题提供一个理想的生物模型[33-34]。鹿茸不是直接从鹿头上长出来的，而是由鹿头部的角柄生长出来的附属器官，角柄也不是与生俱来的，是鹿将要进入青春期时才开始萌发，生长到一定高度（梅花鹿、赤鹿为5～6 cm）时，角柄顶端开始出现稀疏的毛发，并具有光泽，预示着初角茸已经开始发生[34]。然后鹿茸出现快速生长并逐渐成熟，再生的鹿茸生长非常快：梅花鹿的速度能达12.5 mm/d，马鹿的可达27.5 mm/d；秋天到来时，鹿茸逐渐骨化，茸皮脱落，变成骨化的鹿角[35-36]。

组织学研究发现，在鹿角脱落前期，角柄远端部分变得粗糙，且血管化明显，可以将死去的鹿角和活组织角柄区分开来。鹿角一旦脱落，角柄残桩远端的皮肤随即生长并向内迁移，逐渐覆盖角柄断面。随即PP 组织也开始增厚，PP细胞分裂繁殖形成2 个新月形的生长中心。一个在前部，形成鹿茸的眉枝，另一个在后部形成鹿茸的主干。其内部是新生的含有血管的软骨组织，软骨组织上覆盖着一层增生的间质细胞[37]。

研究表明，PP 是驱动鹿茸再生的组织基础；青春期公鹿的额外脊AP组织是角柄和初角茸生成的组织基础。AP 组织的发现揭示了鹿茸发生的秘密。于是设计试验将AP 移植到鹿身体的其他部位，如前额可以在移植处形成完整的异位鹿茸，并且拥有和正常鹿茸一样周期性再生的能力。所以AP 组织是角柄和初角茸发生的关键组织[38]。

基于 AP 和 PP 的独特性，Li 等[39]对这 2 种细胞做了进一步研究，发现这2 种细胞都表达了胚胎干细胞标记物Oct4、Sox2、Nanog、CD9。离体条件下可以诱导分化成软骨细胞、成骨细胞和神经元细胞。确定AP 与PP 细胞都是鹿茸干细胞，AP 细胞（APC）是鹿茸发生的干细胞，PP细胞（PPC）是鹿茸再生的干细胞。

4.2 鹿茸干细胞ECM在修复软骨缺损中的初步研究

我们用大鼠进行关节软骨缺损修复试验研究，将大鼠膝关节造成直径2 mm、深2 mm 的软骨缺损，然后随机分为实验和对照2 个组，对照组大鼠不进行任何治疗，实验组将APC-ECM 填充到软骨缺损处。12周后分别取样做组织染色观察，所得结果如图1 所示，12周时对照组没有出现软骨修复的迹象，缺损处明显，软骨下骨由纤维组织填充修复；实验组APC-ECM 中有软骨细胞产生，缺损部分修复的软骨和边缘的正常软骨结合良好，修复的软骨厚度与正常软骨厚度一样，表面光滑平整，软骨下骨修复与正常软骨相似。

图1 手术后12 周大鼠关节软骨缺损修复Fig.1 Repairation of articular cartilage defect in rats 12 W after operation

4.3 鹿茸干细胞ECM应用前景

鹿茸中富含各种促进骨/软骨生长的细胞因子和功能蛋白。胰岛素样生长因子（Insulin-like growth factor，IGF）是一类鹿茸软骨生长调控因子。鹿茸顶端非骨化区富含IGF受体，并且从上至下mRNA的表达量逐渐减少[40]。TGF 在鹿茸骨膜细胞向成骨细胞转化、细胞外基质合成以及形成新骨等方面具有明显的促进作用[41-42]。在各种细胞因子和功能蛋白的作用下，鹿茸干细胞分裂，分化生成完整的鹿茸组织。使用鹿茸干细胞作为种子细胞培养分泌的ECM 其中保留大量的促进软骨生长的细胞因子，为软骨修复提供了一个新的可能性。

5 展望

使用干细胞修复软骨缺损的想法早有提出并已实施，但将鹿茸干细胞用于修复软骨缺损的研究鲜有报道。经过我们的研究已经初步证明鹿茸干细胞 ECM修复软骨缺损的效果良好。鹿茸干细胞有衍生出完整鹿茸的能力，其可以分泌大量的促进软骨生长的细胞因子和功能蛋白。通过培养诱导鹿茸干细胞分泌ECM保留其中促软骨生长的细胞因子和功能蛋白，并且有效避免病原体传播、炎症等免疫反应的风险，将为软骨修复提供参考。