细胞外基质的免疫原性及组织相容性研究进展

赖芯蕊 蒋 笑 刘宏伟

（暨南大学附属第一医院整形外科，广东 广州 510632）

组织工程与修复再生医学旨在实现对器官和组织的功能性再生，目前的研究热点是如何采用不同的人工与生物材料通过与自身组织细胞或者干细胞整合来实现组织修复与器官再生的个体化[1]。虽然各类生物材料的自体及异体移植在整形外科和修复重建领域运用已比较广泛，但目前正在大力研发的用于组织工程支架的细胞外基质异体移植的可行性尚较少得到关注。细胞外基质是组织内常驻细胞的“自制产物”，是细胞分泌到细胞外的富含胶原和多糖的大分子网状物；不仅是支撑组织、细胞生长的支架， 还能诱导和调控细胞的黏附、生长、增殖和分化[2]。但宿主对其免疫反应及其对组织重塑造成的影响尚未阐明。本文从异体移植引起的宿主免疫反应的传统认识着手，对细胞外基质的免疫原性及其消除手段、宿主对脱细胞移植物免疫反应、细胞外基质的组织相容性及其体内应用的研究进展综述如下。

1 宿主对移植物的体液免疫和细胞免疫反应

宿主对器官移植物的免疫排斥反应已得到广泛研究，而关于异体或异种来源的脱细胞生物材料所引起的宿主免疫反应，相关研究较少。传统理论中，异种器官移植所引起的急性免疫排斥反应主要分为体液免疫反应和细胞免疫反应。前者包括超急性排斥反应( hyperacute rejection，HAR)和异种移植物急性体液性排斥反应(acute humoral xenograft rejection， AHXR)。HAR 是一类在植入带血管的异种移植物后几分钟到几小时内发生的排斥反应[3]。引起HAR 的主要效应因子是在异种器官移植之前就存在于宿主体液循环中、具有外源活性的天然抗体，因此，HAR 属于体液免疫的一种。当异种移植物植入后，这些具有异种活性的天然抗体与异种移植物内相应的抗原结合并激活补体级联反应，补体激活引起血管内皮细胞受损，发生血管内凝血、局部水肿和移植物出血，最终造成器官破坏和移植物功能迅速丧失[4]。HAR 在组织学上的特征表现，一是血管的完整性遭到破坏、发生水肿，并有血栓形成；二是在血管上有抗体和补体终末产物的广泛沉积[5]。HAR 可通过血浆置换的方式来消耗现存的抗体或者抑制受体补体激活，这一措施可使移植物的存活时间延长至超过24 h，甚至长达1 周或更长时间，但随着抗体水平的逐步恢复，最终亦导致移植物衰竭，这一系列反应被称为AHXR，也被称为异种移植物延迟排斥反应。AHXR 是由体液免疫和细胞免疫共同作用的结果。例如，异种肾移植后发生的严重AHXR 的病理特征表现为移植肾组织出现大量间质出血、梗死、坏死、血栓形成、小管丢失伴多形性浸润，免疫球蛋白G (IgG)、IgM 和血小板大量沉积[6]。急性细胞性异种移植排斥反应与HAR和AHXR 不同，其发生与多种免疫细胞相关，通常在异种移植后几天到几周左右发生[7]。异种移植的细胞免疫排斥反应可以由固有免疫和适应性免疫反应介导。这些反应的免疫细胞包括自然杀伤细胞（NK 细胞）、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、T 细胞和B 细胞。

已有不少研究在异种细胞性免疫排斥反应发生中监测到NK 细胞的浸润。NK 细胞作为固有免疫细胞淋巴细胞的一个亚群，通过直接的细胞毒性或抗体依赖的细胞毒性机制来介导移植排斥反应发生。其直接细胞毒性途径是通过激活受体和配体的相互作用来释放溶解颗粒，由多种NK 细胞受体介导调控着激活和抑制信号通路的平衡下，最终引起供体的内皮细胞溶解[8]。例如有异体移植体内实验研究表明，猪内皮细胞的破坏即是通过NK 细胞上受体的识别发生的，人类NK 细胞上的抑制受体对猪主要组织相容性复合体(MHC)I 类分子（猪白细胞抗原I）识别能力差，导致NK细胞激活的抑制信号失效[9]。而抗体依赖的细胞毒性机制，主要通过NK 细胞表面存放抗体的Fc 区域(主要是CD16)与Fc 受体(FcR)结合来活化NK 细胞，并释放含有颗粒酶和穿孔素的可溶性颗粒导致内皮细胞裂解[10]。此外，天然和诱导的抗体沉积在移植物内皮细胞上使诱导型猪白细胞抗原I 被NK 细胞识别，亦能产生抗体依赖的细胞毒性[11]。组织学分析发现，所有发生排斥反应的异种移植物都有巨噬细胞浸润。巨噬细胞通过适应性免疫活化作用和直接细胞毒性作用参与到排斥反应中。此外，T 细胞被认为是介导细胞性免疫排斥反应的关键免疫细胞。异种移植后T 细胞通过直接和间接途径被激活，直接途径中抗原提呈细胞(APCs)激活宿主T 细胞，导致T 细胞介导的细胞毒性直接作用于异种移植血管内皮。间接途径中异种抗原被受体的MHC II 类分子识别并呈递给宿主T 细胞，并导致CD4+T 细胞刺激B细胞产生出新生的抗体，引起异种移植体液性排斥反应[12]。

2 细胞外基质的潜在免疫原性及其消除

2.1 细胞外基质的潜在免疫原性

2.1.1 细胞膜抗原 对异种移植物的研究发现，移植后HAR 的发生与细胞膜上存在的Gal（半乳糖）抗原表位具有较强关系，尤其是α-Gal 表型( Gal alpha1，3-Gal beta1-4GlcNAc-R)，它作为细胞表面分子在除人类和部分灵长类动物外的大多数物种中存在，而人类血清中具有天然的Gal 抗体[13]。此外，哺乳动物的大多数同源蛋白含有免疫原性肽，当其作为移植物植入人体时能诱导人体产生非Gal 抗体，但非Gal 抗体的形成比诱导的Gal 抗体需要更长时间[14]。Gal 抗体和非Gal 抗体都能与细胞外基质结合，并通过诱导巨噬细胞介导植入物的广泛降解对人类细胞外基质植入物的再生产生负面作用[15]。使用缺乏α-Gal 表位的哺乳动物细胞外基质植入物可以有效避免抗Gal 免疫屏障。也有研究表明，Gal 表位引起的宿主免疫反应还不足以对细胞外基质的组织重塑产生明显负面作用。Hashimoto等[16]利用大鼠肺器官支架模型来评估细胞外基质在脱细胞- 再细胞化大鼠肺的损伤和重建，他们采用了大鼠或人内皮细胞和脂肪源性干细胞(ASCs)来再细胞化，结果提示，细胞外基质的再生特性可能取决于其浸润的细胞种类和类型；而使用人类细胞再细胞化可消除α-Gal 抗原的影响。亦有部分研究指出在异体组织移植前可通过掩盖抗原表位的方式来消除其免疫效应，如采取戊二醛化学交联的方式，使异种蛋白质无法被人类的免疫系统识别[17]。

2.1.2 细胞核酸物质残留 脱细胞后的异体生物材料中残存的脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸通常被认为具有较强的免疫原性，是引起细胞外基质移植后炎症反应的主要原因[18]。考虑到组织中细胞是以一种嵌入方式与细胞外基质紧密结合，在保证细胞外基质一定生物效能的情况下，就算是格外严苛的脱细胞程序也无法保证完全清除所有的细胞核酸物质。大多数商用的生物支架均能检测到微量的DNA 残留，但残留的DNA 通常以小片段肽段形式存在，从而能够减少对移植物后期重塑造成的影响。有研究中指出，生物细胞外基质水凝胶中可接受的残留DNA 数量的最低标准是冻干细胞外基质中长度小于300 bp 的DNA 片段含量低于50 ng/mg[19]。因此，未来需要改良脱细胞工序，在尽可能保证脱细胞产品效能的情况下降低核酸物质残存率，以此来提高脱细胞生物材料的质量。

2.2 免疫原性消除方法 通常我们在细胞外基质制备过程中会使用涉及物理、化学及生物的各种方法，利用不同细胞外基质来源组织的特有性状和组成成分，采取相应特殊的制备处理方式。一般通过物理或化学的方法破坏特定的细胞结构，然后再采用各种特定蛋白水解酶来消除细胞与细胞外基质之间的相互作用并去除免疫原性成分。如何在消除组织免疫原性前提下尽量保证细胞外基质的再生生物学性能是仍需深入探究的问题。其中关于细胞外基质内毒素的残留率对细胞外基质后期组织重塑的影响是目前研究新方向之一。

3 细胞外基质的组织相容性

在细胞外基质中，脱细胞脂肪组织(decellularized adipose tissue， DAT)、 脱 细 胞 真 皮 基 质(acellular dermal matrix， ADM)、 脱 细 胞 软 骨 基 质(acellular cartilage matrix， ACM)和脱细胞骨细胞外基质(acellular bone matrix， ACBM)已逐步在整形修复重建领域中开发，目的是通过将脱细胞组织移植于软组织缺损部位，并与受体自身组织细胞或干细胞整合来达到组织修复与重建目的。

3.1 DAT 与种子细胞相互作用的影响 DAT 作为一种生物支架，首先，它所具有的特定三维立体结构、力学特性是细胞的基本生存空间；其次，它含有的蛋白成分对细胞黏附有一定影响，而且蛋白所具备的细胞因子分泌功能能对细胞增殖分化产生特定诱导作用。有研究指出，DAT 支架不仅对ASCs 无细胞毒性，还能促进脂肪干细胞迁移和增殖，使其发挥血管化和脂肪组织再生的潜能[20]。Cheung 等[21]将应用光交联方法制备的高水合的DAT 与ASCs 进行体外相容性实验，结果提示其为ASCs 提供了富含胶原蛋白和层粘连蛋白的细胞黏附基质，增强了细胞的长期生存和保留能力。Getova 等[22]在关于DAT 水凝胶化后对成纤维细胞的细胞毒性作用的研究中，分析了共培养7 d 细胞的穿透和迁移能力，显示，该水凝胶性状的DAT 并无明显细胞毒性作用。此外，考虑到ASCs 本身就具有多向分化潜能，该影响的产生可能与ASCs 自身分泌促血管生成因子相关。

3.2 ADM 与种子细胞相互作用的影响 ADM 是人或动物皮肤真皮组织经脱细胞处理而成，主要由胶原蛋白、纤维连接蛋白、层粘连蛋白等一些功能蛋白以及少量的糖蛋白、糖胺聚糖、蛋白聚糖等组成，具有与天然真皮相似的结构和成分。ADM 能够为间充质干细胞(MSCs)的存活提供具有良好生物学特性的天然三维结构。干细胞移植作为一种临床促伤口愈合的新兴治疗手段近年来受到广泛关注，但干细胞保留率低使其应用受限，其部分原因是在炎症反应过程中诱导出的富含活性氧(ROS)的恶劣微环境导致。Lin 等[23]研制出的新型壳聚糖(CHS)/ADM 干细胞传递系统，被证实能显著调节干细胞内ROS 水平并减少ROS 诱导的细胞死亡；更重要的是，这种MSCs 传递系统能显著增强体内移植干细胞的滞留，继而促进血管生长，加速伤口愈合。还有研究通过皮肤全层缺损创面模型证实，与无细胞支架相比，ADM 支架上的ASCs 能够促进再上皮化、血管生成和胶原重构[24]。除此之外，ADM 也能为成纤维细胞和内皮细胞的内流提供良好的微环境，促进新的血管网络形成[25]。而成纤维细胞进入支架后不仅能够分泌胶原纤维等合成为新的细胞外基质，还能增加生物支架的活性，同时通过释放胶原酶等使原基质分解，继而达到组织重塑的作用[26]。张文文等[27]研究指出，猪脱细胞真皮基质(pADM)在体内能够上调肿瘤坏死因子-α 对毛囊角质细胞Wnt3a 蛋白/β-连环蛋白信号通路表达，提示pADM 可能有促进毛囊再生的作用。

3.3 ACM、ACBM 与种子细胞相互作用的影响 ACM 主要由II 型胶原和纤维蛋白、蛋白多糖、透明质酸和硫酸软骨素组成的连锁网状结构构成[28]。ACM 可促进骨髓间充质干细胞的迁移和成软骨分化，其作用机制可能与软骨外基质的胶原成分和软骨生长因子有关[29]。因此，ACM 特殊的构造不仅能促进细胞迁移，还可以诱导干细胞的黏附和增殖。ACBM 保留了天然网状结构和骨矿支架以及羟基磷灰石等无机成分。ACBM 支架的三维连通多孔结构支持了骨髓间充质干细胞的增殖和附着，并分泌大量的细胞外基质；体外试验证实了其对骨髓间充质干细胞没有细胞毒性作用[30]。ACBM 中松质骨部分作为软骨再生支架的主体，在多种促软骨形成细胞因子的作用下，能够促进软骨细胞成软骨分化[31]。人胚胎干细胞移植到ACBM 支架上会出现成骨表现，且通过对低、中、高3 种不同骨基质密度支架对比试验发现，人胚胎干细胞在中等密度组的成骨作用最明显，这可能是由于中等密度的ACBM 支架能使营养物质和代谢物的运输率、细胞浸润的空间以及支架机械强度达到最佳效果[32]。

4 细胞外基质体内应用研究进展

4.1 DAT 体内应用 关于DAT 的研究主要集中在其作为生物支架应用于脂肪组织工程的体内外研究，以及在皮肤软组织创面修复、乳房修复重建、软骨及骨再生等方面的应用研究。Flynn[33]提出DAT 能为脂肪形成提供诱导微环境，促进体内和体外的脂肪再生。Turner 等[34]将大鼠的ASCs 分别播种于DAT 和明胶微载体，再将其注射到大鼠背部皮下，结果，在28 d 内移植部位表现出稳定的体积保留。此外，用同种异体大鼠ASCs 预播种的DAT 微载体可增强移植区域内的细胞浸润和血管生成。Han 等[35]利用具有免疫活性大鼠模型探究DAT 对体内脂肪再生的影响，结果表明，DAT 支架为脂肪形成提供了一个有利的微环境，而ASCs 可促进有益宿主细胞群的招募来帮助协调这种反应，例如其促进了具有组织重建性质的巨噬细胞表型分化。近年，王一名等[36]利用猪皮肤软组织创面模型进行体内实验研究，结果提示DAT 联合负压封闭引流治疗皮肤软组织创面，可以减少中性粒细胞浸润，调节炎症反应以及巨噬细胞表型，有利于创面组织修复再生。Mohiuddin 等[37]使用小鼠骨缺损模型对DAT 水凝胶的组织修复再生作用进行了研究，观察到DAT 水凝胶增强了I 型胶原和骨桥蛋白的表达；X 线断层扫描结果显示，DAT 水凝胶治疗组有明显骨再生。并且，DAT 已被证明是一种实用的乳房整形手术的生物材料，能达到重塑或修改乳房外观的目的。Haddada 等[38]对DAT 的生物力学适用性进行了评估，显示，在负载条件下，DAT 用于乳房切除术后重建的乳房均未出现轮廓缺损。

4.2 ADM 体内应用 ADM 是生物支架材料中研究得十分成熟的一种脱细胞基质，且亦有不少商品化的ADM 产品应用于临床。现今，ADM 在临床上应用已较为广泛，包括烧伤、慢性溃疡和各种软组织缺损创面的再生重建，以及在体表美容整形方面的修复重建。如在应用ADM 联合Meek 微型皮片移植治疗大面积烧伤创面修复的临床对照试验中，被证实二者联合应用可缩短手术时间，加快皮片融合，且皮片成活率更高[39]。人ADM 支架复合植皮治疗糖尿病足溃疡的一项随机对照试验表明，该方法能够减少复发率，且组织修复后具有更好的物理性能[40]。但是，在一项关于ADM 应用于乳腺癌乳房重建的安全性数据分析的临床试验中发现，ADM 组远期观察发现有发生并发症和再次手术的趋势，且出现伤口愈合问题的风险更高[41]。然而，关于ADM 的研究证据大多数来自描述性和非随机的临床研究，因此还需要更多的大型随机临床试验来提供更有力的循证医学证据支持。4.3 ACM、ACBM 体内应用 ACM、ACBM 因具有特有的促成骨性能，主要应用于各类骨再生与骨缺损修复。有研究将制备出的一种可注射热敏PEG-PCL-PEG 水凝胶/ACBM 复合物植入兔颅骨缺损模型中，发现新骨同时从缺损的边缘和中心开始形成，20 周时缺损部位已完全闭合；且新生骨质的骨密度影最终与宿主皮质骨接近[42]。近几年，仿生软骨脱细胞基质微球(bionic cartilage acellular matrix microspheres)作为一种特殊方法制备的ACM 已应用于软骨缺损治疗的研究中。除骨与软骨修复应用研究外，也有将ACM 应用于新领域的尝试。Yun 等[43]将软骨脱细胞基质消化悬液应用于兔角膜新生血管模型，发现其治疗潜力与贝伐珠单抗相当，能有效抑制损伤角膜的新生血管形成。

5 总结与展望

在细胞外基质实现异体移植过程中，如何安全性应用是关键问题，同时，我们应该在保障安全性应用前提下尽可能提高应用细胞外基质所能达到的效能。保障移植安全性的核心方式是对移植后免疫排斥反应发生情况进行有力地掌控。现今研究主流方向仍是从细胞外基质的制备过程入手，解决其本身所具备的免疫原性问题。虽然目前很多研究或共识普遍认为细胞外基质作为一种脱细胞的组织不具有免疫原性，但关于其移植后的宿主发生免疫应答以及移植物本身的免疫原性仍需深入研究，尤其是其用于异体移植时，其潜在的免疫原性是否对其生物相容性产生影响等都需进一步阐明。对细胞外基质移植后免疫反应及其机制以及不同细胞外基质生物相容性的研究，有利于细胞外基质广泛运用于科学研究及开发出更多安全的细胞外基质产品，最终能达到安全性与有效性的平衡，实现组织修复的最佳效能。