针刺手法对自发性高血压大鼠胸主动脉BKCa离子通道细胞电生理的调控研究*

王 洋 ，张丽丽 ，赵孟雄 ，杜 凯 ，沈 燕 ，5，韩 林 ，申鹏飞 ，王 舒 ，5

（1．天津中医药大学第一附属医院针灸科，天津 300193；2．国家中医针灸临床医学研究中心，天津 300193；3．天津中医药大学，天津301617；4．天津市针灸学重点实验室，天津 300193；5．天津市针灸研究所，天津 300193）

高血压是以体循环动脉压升高为特征的临床综合征，动脉和小动脉血管平滑肌张力是血管阻力和高血压的决定因素[1]。血管平滑肌的钾离子通道可通过调节膜电位来决定血管张力：钾离子通道激活可导致膜超级化，引起血管舒张；抑制钾离子通道导致膜去极化，引起血管收缩[2]。大电导钙激活钾通道（BKCa）在血管平滑肌上表达密度最高，其因电导大、电压依赖性强和钙离子依赖性高区别于其他离子通道，在高血压中发挥着重要的调节作用[3-4]。本研究采用“活血散风”针刺法干预自发性高血压动物模型，以针刺效应的重要影响因素——针刺手法为切入点，观察针刺手法对BKCa通道电生理特性的影响，从离子通道角度为针刺降压提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 24只健康雄性自发性高血压大鼠，16周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK（京）2007-0001。实验大鼠按照随机数字表法分为模型组、针刺手法组、针刺无手法组，每组8只；同等周龄健康雄性WKY大鼠8只，作为正常对照组。实验室温度20～25℃，湿度 40%～50%，光照时间 7∶00-19∶00。自由摄食、饮水。所有动物的处置符合中华人民共和国科技部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》相关规定。

1.2 主要试剂及仪器 主要试剂：DMEM细胞培养基、胎牛血清（Gibco，美国），N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸（HEPES）（Santa Cruz，美国），DMSO、氯化钾、氯化钠、氯化镁、氯化钙（Sigma，美国）等。

1.3 主要仪器：膜片钳放大器（EPC-10，HEKA，德国），数据采集软件 Patchmaster（Patchmaster，HEKA，德国），数据分析软件（HEKA，德国），程控玻璃微电极拉制仪（P-97，Sutte Instruments，美国），微电极操纵器（MP-285，Sutter Instruments，美国），显微镜（LX71，Olympus，日本），倒置显微镜（Nikon Ti-S，日本）等。

1.4 治疗方法 参考中国针灸学会实验针灸研究会制定的“动物针灸穴位图谱”，并根据课题组前期研究大鼠人迎穴定位[5]，实验选择大鼠两侧下颌骨隅突连线下（8．0±0．3）mm，前正中线旁（5．5±0．4）mm。

针具选用苏州医疗用品厂生产的“华佗牌”毫针，长25 mm，直径0．20 mm。针刺手法组针刺深度5 mm，施用小幅度（＜90°）、频率 120次/min的手法1 min，留针15 min；无手法组针刺后不施用手法，留针 15 min；每日上午 8∶00-9∶00 进行干预，5 次/周，共4周；正常对照组和模型组不进行针刺，但每天在同一时间段使用与针刺手法组相同的方法抓取和固定。

1.5 观察指标及检测方法 1）血压测量：使用日本Softron无创血压仪进行鼠尾血压测量。在室温（22±2）℃条件下，测量大鼠安静、清醒状态鼠尾血压，连续测量3次，取平均值。测量干预前、干预1、2、3及4周的收缩压和舒张压。2）BKCa离子通道功能检测：细胞培养：大鼠腹腔注射25%乌拉坦0．75 g/kg，麻醉。颈椎离断，75%乙醇消毒腹部皮肤，剪开腹腔至胸腔，取下胸主动脉至主动脉弓，放入冰的HBSS中，显微镜下去除主动脉周围的残存脂肪和软组织，胸主动脉放入消化液中，37℃、5%CO2消化30 min（目的分离内膜和外膜）。显微镜下剥离外膜，将去除外膜层的主动脉转移至37℃预热的DMEM完全培养基中，37℃、5%CO2孵育3 h；将主动脉剪成1～2 mm宽的环状组织，转移到培养皿的主动脉消化液中，37℃、5%CO2消化2 h，在此期间，间歇性用吸管吹打组织，使酶与组织保持充分接触。在消化液中加入5 mL 37℃预热细胞培养液终止消化液，将所有细胞及液体转移至15 mL离心管中，1 000 r/min，离心5 min。弃上清，加入适量体积的新细胞培养液，将细胞接种于明胶包被的细胞培养板或细胞爬片中，48 h后用于膜片钳检测。

电生理记录：显微镜下，用入液电阻在3～5 MΩ的电极封接细胞，形成G欧姆封接后，抬起电极撕掉细胞膜，形成在内面向外记录模式。记录单通道BKCa电流，实验数据由EPC-10放大器（HEKA）进行采集并存储于PatchMaster（HEKA）。采用1～5 kHz滤波，数字采样频率20 kHz，所有实验操作在室温22～25℃下进行。数据分析采用Fitmaster软件进行，开放概率用NPo表示，N表示单个通道的数量，Po表示单个通道的开放概率，使用以下公式计算：NPo：Ao表示关闭状态的振幅柱状图曲线下的区域，A1-An表示1-n个通道的不同开放状态电流水平的柱状图区域。

1.6 统计学处理 应用SPSS 23．0软件进行数据分析，计量资料的描述用均数±标准差（）表示，不同时点血压比较采用重复测量的方差分析，相同时点组间血压、离子通道开放时间和开放概率均数比较采用单因素方差分析，各个实验组之间的两两比较采用LSD法，P＜0．05代表差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血压水平比较 模型组、针刺手法组、无手法组的收缩压和舒张压均明显高于正常对照组（P＜0．05），针刺手法组在治疗 1、2、3、4 周血压值显著低于模型组（P＜0．05），无手法组在治疗 1周时收缩压和舒张压均低于模型组（P＜0．05），在治疗2和 3 周时收缩压低于模型组（P＜0．05）；针刺手法组与无手法组比较，尚未发现有统计学差异（P＞0．05）。5次血压测量时点间、不同分组间均有统计学差异（P＜0．05），分组与测量间有交互作用（P<0．05）。见图 1。

2.2 各组大鼠主动脉BKCa通道电流、电导的比较 正常对照组和模型组BKCa通道电流幅度随超极化程度加大而增大，在相同钳制电压下，通道电流幅度无统计学差异（图2A、2B）。与模型组比较，针刺手法组、无手法组可增强BKCa通道电流幅度，但差异均无统计学意义（图2C、2D）。由电流-电压关系曲线（IV曲线）的斜率得出所记录的单通道电导均值为 291．3 pS（膜片数=8）（图 2E、2F）。不同钳制电压下，各组 BKCa通道的电流无明显改变（P＞0．05）。

图1 4组大鼠不同时点血压水平比较（，n=8）Fig.1 Level of blood pressure at different time in the four groups（，n=8）

2.3 各组电流在+40 mV时开放时间、开放概率的比较 见图3，模型组开放概率明显低于正常对照组（P＜0．05），针刺手法组的开放概率高于模型组（P＜0．05）；无手法组与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0．05）。在开放时间方面，模型组低于正常对照组（P＜0．05），而针刺手法组、无手法组与模型组比较，均无统计学差异（P＞0．05）。

3 讨论

高血压血管平滑肌张力变化与膜电位密切相关，离子通道是影响膜电位的重要因素。血管平滑肌上存在着5种钾通道：电压依赖性钾通道、BKCa、内向整流钾通道、三磷酸腺苷（ATP）敏感性钾通道及串联双孔钾通道[2]。其中BKCa通道具有电导大、对钙离子（Ca2+）敏感性高、电压依赖性强的特点，通过Ca2+和膜电位这两种细胞信号，反馈调节细胞内离子平衡及细胞兴奋性[6]。BKCa通道表达减少、失活或阻滞可导致血管收缩，血压升高，如BKCa通道的特异性阻滞剂阻断BKCa后冠状动脉压力剧烈升高[7]；BKCa通道激活剂可解决动脉压力增高问题。因此，BKCa通道的研究为预防和治疗高血压提供了新的靶点。

图2 各组单通道膜BKCa电流记录及IV曲线Fig.2 Record of single-channel membrane BKCa current and IV curve

图3 各组单通道膜BKCa开放概率、开放时间（，n=8）Fig.3 Single-channel membrane BKCa opening probability and opening time（，n=8）

研究采用单通道膜内面向外模式记录BKCa的变化，发现模型组与正常对照组胸主动脉平滑肌BKCa在相同钳制电压下电流无明显差异。本研究还发现与正常对照组大鼠相比，模型组胸主动脉平滑肌细胞BKCa通道的开放时间和开放概率降低，而人迎穴施用针刺手法可提高该通道的开放概率，而不施用针刺手法对其开放概率无明显影响。目前关于高血压大鼠不同组织平滑肌BKCa通道研究结果如下：有研究发现12周龄自发性高血压大鼠的肠系膜动脉平滑肌BKCa电流增强、开放概率增加[8-9]；高盐饮食所致高血压大鼠血管平滑肌细胞膜BKCa电流随高盐饮食时间的延长而增大[10]；LIU等[11]应用全细胞膜片钳发现12～16周龄模型组大鼠脑血管平滑肌细胞电流增强，而单细胞膜片钳技术发现与正常对照组比较，模型组在不同膜电位下的BKCa电流、电导无明显变化。研究发现BKCa通道与年龄相关，随着月龄的增加，高血压大鼠BKCa通道的开放时间、开放概率、瞬时外向电流幅度及频率明显降低[12]。因此推测高血压早期机体血液动力学存在一定的自我调节与代偿，而后期可能出现失代偿，BKCa通道功能与表达变化可能是机体为适应血液动力学变化而进行的自我调节。

石学敏院士认为，高血压的病机是气血脉失司，创立了“活血散风”针刺法，近年来广泛应用于高血压的治疗，效果显著。人迎穴是“活血散风”针刺法的主穴，是气海的“营运之输”。气海理论认为，血液在脉管中运行不息，流布于全身，环周不休，自成体系，因此气海最基本的物质结构和基础是气、血、脉：气推动血液在脉内运行，形成血压。针刺人迎穴可调理气海、通利血脉，长期的针灸临床研究证实，对人迎穴施以适当的手法或刺激，降压效果明显[13-14]。

捻转、提插是最基本的针刺手法，足够、有效的刺激量是获得疗效的关键[15]。针刺手法是产生针刺效应的重要影响因素，研究发现，针刺刺激产生组织移位达100 μm[16]，组织的移动会刺激细胞中胞质Ca2+增多，Ca2+振幅增大、存储，导致体内血浆中Ca2+和内啡肽的释放[17]。其中Ca2+通道是细胞内最主要的反应通道。而BKCa通道激活与胞内Ca2+浓度及肌浆网钙火花偶联有关[18]。针刺如何调节BKCa通道达到降压的机制还需进行深入研究。