非小细胞肺癌耐药机制及其逆转耐药的研究进展

郭亚楠 蒋兵 郭红云 王涛 张永东 苏海翔，

1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州730000；2.甘肃省医学科学研究院/甘肃省肿瘤医院，甘肃 兰州730050

据中国肿瘤登记中心2018 年发布的数据显示，肺癌在我国男性肿瘤发病患者中占首位，在女性中位列第三［1］。按照病理类型，肺癌可分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌两大类，非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）约占80%［2］。靶向治疗、细胞治疗和免疫治疗的快速发展为患者带来了希望，但目前化疗仍然是NSCLC 治疗的主要手段。肿瘤细胞对化疗药物的耐药性是导致临床化疗失败的主要原因。因此，对多药耐药（multidrug resistance，MDR）机制的研究仍是当今肿瘤研究领域的一个热点。肺癌的MDR 机制涉及膜转运蛋白介导的药物外排泵、酶介导的肿瘤细胞解毒和DNA 修复功能增强、凋亡调控基因异常、信号转导因子发挥抗凋亡机制等多种途径，这些途径中的关键基因和蛋白都与诱发肿瘤细胞形成耐药表型相关［3，4］。本文就近年来有关肺癌MDR 的机制研究及中药在逆转NSCLC 耐药性方面的研究进展作一简单综述。

1 ATP 结合盒转运体蛋白

ATP 结合盒转运体（ATP-bingdingcassettetransport，ABC 转运体）蛋白家族是一大类跨膜蛋白，广泛存在于各种生物体。ABC 转运体利用ATP 水解产生的能量将底物（包括抗癌药物）从细胞内排出，使细胞内药物的浓度降低，在肿瘤细胞表现为耐药。在ABC 转运蛋白家族中研究较多的是磷酸化糖蛋白（phosphorylated glycoprotein，P-gp）、MDR 相关蛋白（multidrugresistanceassociated protein，MRP）、乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）等。这些细胞膜药物转运蛋白均依赖ATP 供能发挥“药泵”作用，能把进入细胞内的药物排出细胞外，降低细胞内药物浓度，导致药物细胞毒作用减弱甚至丧失，降低药物对肿瘤细胞的杀伤作用，从而导致肿瘤细胞耐药［5］。

1.1 P-gp P-gp 由MDR1 基因编码，是MDR 中发现最早的耐药蛋白，属于ABC 转运体蛋白家族中一员［6］，主要分布在细胞膜上，是一种能量依赖性的跨膜磷酸糖蛋白，在许多MDR 肿瘤细胞株、原发性和获得性耐药的癌症患者肿瘤组织中都检测到了P-gp 在细胞膜上的过度表达。耐药性的产生是由于P-gp 通过其疏水位点和疏水性，与紫杉醇、蒽环类等抗肿瘤化疗药物结合，将进入细胞内的药物泵出细胞，表现为耐药，Pgp 高表达是导致MDR 现象的重要依据［7，8］。在NSCLC细胞系SW-1573 中通过递增阿霉素浓度的筛选，获得了MDRP-gp 的过表达，细胞表现为MDR［9］。Solazzo等［8］研究表明，P-gp 在细胞膜上的过度表达可以使多种药物从细胞中分离出来。研究也表明，NSCLC 肿瘤组织中的P-gp 过表达［10，11］。因此在NSCLC 多药耐药中，P-gp 过度表达是其产生耐药的关键因素。通过降低MDR1 基因的表达，抑制P-gp 的功能是目前逆转多药耐药性的主要方法之一。

1.2 MRP MRP 在ABC 转运体蛋白亚家族蛋白质线性序列分类中属于ABCC。在目前研究中，MRP 共有13 个成员，其中有9 种与肿瘤耐药相关，包括MRP1～MRP9，MRP 与P-gp 一样属于ATP 结合盒式跨膜转运蛋白超家族成员［12］。在NSCLC 中MRP1 蛋白表达水平比在小细胞肺癌中高，并且还发现MRP1水平与肺癌细胞对阿霉素、长春新碱、足叶乙甙的敏感性下降有关，说明MRP1 与肺癌的MDR 有关［13］。MRP 导致NSCLC 产生耐药的机制主要有三个方面，一是MRP在NSCLC 细胞中的作用与P-gp 相似，但作用底物与P-gp不同，MRP 主要通过与谷胱甘肽（glutathione，GSH）结合，将其底物转运出细胞外，使细胞内的化疗药物浓度降低；二是MRP 能使抗肿瘤药物在细胞内重新分布，使化疗药物远离靶点，间接导致耐药［14］；三是MRP 可以降低细胞内的pH 值，在酸性环境中，药物被质子化后大量外排，导致耐药［15］。在小细胞肺癌和NSCLC 标本中，发现87%的NSCLC 肿瘤块中都可检测到的MRP，并且MRP 以高表达的形式存在于NSCLC 耐药细胞中［16］。研究也表明，NSCLC 肿瘤组织中MRP 过表达［17，18］。Wang 等［19］检测了NSCLC 肿瘤组织中MDR1和凋亡相关基因p53、Bcl-2 的mRNA 表达情况，发现63 例NSCLC 的MDR1 mRNA 阳性表达率为81.0%（51/63）。MDR1 同时也是NSCLC 判断预后的一个指标，还与凋亡相关基因的共表达有关。Gen 等［20］为了探讨MRP 基因过表达对NSCLC 患者预后的影响，检测了47 例NSCLC 根治术后石蜡包埋组织中MRP 的表达，发现MRP mRNA 均过表达，随访发现，其过表达水平与患者的生存时间、化疗疗效、术后复发或转移等有关，与组织学类型、肿瘤大小、淋巴结转移、TNM 分期、分化程度、年龄、性别无关。MRP mRNA 过表达可能作为判断NSCLC 预后的一个指标。

1.3 BCRP BCRP 是ABC 转运蛋白超家族的新成员，被确定为抗癌药的药物外排泵，最早由Doyle［21］从乳腺癌细胞系MCF-7/AdrVP 克隆出来。BCRP 不仅存在于肿瘤细胞，也分布于正常组织，但组织分布特征不同。BCRP 分子上有1 个ATP 结合位点及6 个跨膜区结合点位，通过外排细胞内ATP 依赖的药物而使细胞产生耐药性［22］。与BCRP 耐药机制相关的化疗药物有蒽环类、多柔比星、依托泊苷、紫杉醇等。用免疫组化方法检测72 例确诊的NSCLC（ⅢB 和Ⅳ期）肿瘤组织中BCRP 的表达，33 例为阳性［23］。应用肿瘤细胞体外培养和药敏实验法对60 例未经化疗的NSCLC 患者行体外化疗药物多柔比星、紫杉醇、顺铂的敏感性检测，用免疫组织化学方法对BCRP 在NSCLC 中的表达进行检查，将其表达情况与对应的化疗耐药性进行相关分析，结果显示BCRP 参与介导NSCLC 的MDR［24］。对66 例接受以顺铂为基础的化疗的NSCLC 患者经支气管活检分析，发现BCRPmRNA 的表达水平较高［25］。因此，BCRP 是NSCLCMDR 的指标之一。

1.4 肺癌MDR 中P-gp、MRP、BCRP 之间的关系 MDR中P-gp、MRP、BCRP 之间的关系三者之间的相同点：P-gp、MRP 及BCRP 均属于ABC 转运蛋白超家族成员，功能上极其相似，参与MDR 的机制均是依赖ATP的药物转运泵的作用将化疗药物排出体外，降低细胞内药物浓度从而使细胞表现为耐药。三者间的不相同点：P-gp、MRP 及BCRP 三者之间的不同点表现在四个方面。一是转运子不同：P-gp、MRP 为全转运子、BCRP 为半转运子，MRP 与P-gp 以全-转运蛋白的形式发挥作用，可使药物外排能力明显提高，降低蒽环类（柔红霉素、阿霉素、去甲氧柔红霉素）、长春新碱、鬼臼霉素类等天然化疗药物在细胞内的浓度，从而减弱这些化疗药物的细胞毒性。BCRP 为半-转运蛋白，需与其他转运分子形成二聚体或多聚体活性蛋白复合体而发挥作用。二是结构不同：P-gp、MRP 由两个同源部分组成，每部分含有一个ATP 结合结构域和一个跨膜的疏水区域，BCRP 的结构中只有一个ATP 结合结构域和一个疏水性的跨膜结构域。三是耐药谱不同：MRP1 与P-gp 过度表达对蒽环霉素、阿霉素、长春新碱、紫杉醇以及烷化剂丝裂霉素等都产生耐药性。但是两者也有很大区别。首先，MRP1 对紫杉醇、烷化剂等没有耐药性，其次，MRP1 对氨甲蝶呤会产生短期高效的耐药性，但无长期耐药性。表明MRP1 能转运氨甲蝶呤，但不能转运其多聚谷酰氨酰化的代谢物［26，27］。BCRP过度表达可导致对药物敏感的细胞对米托蒽醌、柔红霉素、阿霉素、拓扑替康、SN-38（伊立替康的活性代谢物），但BCRP 过度表达对长春花生物碱、紫杉醇和顺铂药物不转运。四是耐药机制不同：MRP 介导的药物外排需要GSH 的参与，需要MRP 的底物（如足叶乙苷，柔红霉素和顺铂等），通过MRP/GS-X 泵外排，它不能直接转运其介导耐药的未经修饰的药物［28］，细胞内GSH的水平和谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione S-transferase，GST）的活化与MRP 介导的MDR 有关［29］，P-gp 和BCRP一样，BCRP 也不需要GSH 协助转运中性两极药物。

2 LRP

肺耐药蛋白（lung resistance-related protein，LRP）是参与细胞内药物运输过程的复杂蛋白，分布于胞质及核膜。与P-gp、BCRP、MRP 不同，LRP 不是ABC 转运蛋白，主要位于细胞质中，在调控胞核与胞质之间物质交换和囊泡运输中起作用，其能阻止以胞核为靶点的化疗药物（如蒽环类抗肿瘤抗生素、长春新碱类、顺铂和卡铂熔化剂等）通过核孔进入胞核，即使药物进入胞核发生药效前通过胞吐形式把药物排至胞外［30］，从而降低核内药物浓度，最终导致肺癌对化疗药物耐药。因此，LRP 基因的过度表达，提示LRP 可通过核靶点屏蔽作用而产生MDR。此外，因LRP 可以介导细胞核和细胞质之间的细胞毒性药物的转运，所以LRP 引起MDR的机制还表现在其可以使具有细胞毒性或抑制性的化疗药物隔离在微囊内而不能发挥作用，使细胞内的药物浓度降低，诱导产生MDR。朱等［31］采用免疫组化方法检测168 例NSCLC 组织中的LRP 表达结果显示LRP 表达的阳性率为64.03%，随访部分患者发现，LRP高表达的NSCLC 患者2 年生存率明显低于LRP 阴性患者，说明在NSCLC 中LRP 参与了阻止顺铂和紫杉醇等化疗药物对肿瘤细胞DNA 的破坏。检测肿瘤组织LRP 的表达情况可能对预测NSCLC 的耐药以及预后有指导意义。LRP 阳性的肺癌细胞耐药谱广，尤其对顺铂、阿霉素、足叶乙苷［32］。NSCLC 中LRP mRNA 的阳性表达率也明显高于正常组织，与细胞分化程度、组织学分级及临床分期无关［33］。LRP mRNA 的表达也可以作为NSCLC 耐药的指标。

3 GST

GST 是体内生物转化过程中最重要的Ⅱ相代谢酶之一，也是细胞抗氧化还原损伤、抗癌变的主要解毒系统酶。GST 能单独与许多抗肿瘤药物如顺铂、丝裂霉素、阿霉素等结合，形成一种易排泄的复合物。当GST呈现高表达水平时可促使药物从肿瘤细胞排出，最终导致耐药［34］。因此，GST 是肺癌产生耐药的机制之一。GST 包括5 种同工酶，其中表达最高的是GST-π［35，36］。GST-π 是继P-gp、MRP、LRP 后备受关注的MDR 相关蛋白，在许多耐药细胞系中高表达，且表达水平与耐药程度相关。NSCLC 癌组织中GST-π 阳性表达水平显著高于癌旁组织，说明在癌组织中存在由GST-π 介导的原发性耐药，且GST-π 可能与肿瘤的发生有关［37］。GST-π 在腺癌中的阳性率高于鳞癌［24］。GST-π 参与介导NSCLC 的MDR，在NSCLC 中的阳性表达可作为MDR 的指标［38，39］。

4 TOPOⅡ

拓扑异构酶（topoisomerase，TOPO）是存在于细胞核中的重要酶类，分为TOPOⅠ和TOPOⅡ两类。其中，TOPOⅡ即“回旋酶”，是真核细胞中DNA 复制和转录过程中不可缺少的酶，也是与肿瘤耐药相关的主要酶。TOPOⅡ的主要功能表现在两方面：一是作为与抗肿瘤药物结合的靶点，当细胞内TOPOⅡ表达水平下降时，会影响化疗药物在抗肿瘤中发挥作用，导致肿瘤细胞对药物的敏感性下降，从而产生耐药；二是作为一个表达G2/M 期细胞的增殖指数，当其表达增加时意味着肿瘤细胞增殖加快、恶性程度高。TOPOⅡ在NSCLC 组的阳性表达高于对照组，且随着细胞分化程度的降低表达增强，其表达可作为肿瘤耐药性的重要指标。宿利清等［40］进行了TOPOⅡ在肺癌耐药机制中的表达及与化疗药物耐药相关性的研究，发现TOPOⅡ的较低表达与肺癌耐药有关，涉及的药物有顺铂、紫杉醇、异环磷酰胺等。因此，TOPOⅡ的较低表达可以作为NSCLC MDR 的指标之一。

除P-gp、MRP、LRP 蛋白、GST 和TOPOⅡ酶外，肺癌的耐药性还与凋亡基因Bcl-2 基因、p53 基因表达水平有关，与NF-kB、PI3K/Akt、PKC 信号通路等也有关。NSCLC 中活化的肿瘤相关巨噬细胞可以使肿瘤细胞MDR-1 蛋白的表达增加，也与肺癌化疗耐药有关。

5 中药逆转NSCLC 耐药的研究

有关中药单体成分、提取物及复方在逆转非小细胞肺癌耐药方面的研究表明，中药可通过降低P-gp 和MRP 能量依赖性药物排出性膜泵的作用减弱LRP 的细胞核屏蔽功能、降低GST 参与的细胞药物代谢作用、提高TopoⅡ的活性、改善抗凋亡机制失衡等多种途径起到逆转耐药的作用。文献资料中较为常见的有：

5.1 柚皮苷 可通过上调Bax 和cleaved caspase3 的蛋白水平，下调Bcl-2 的蛋白水平，剂量依赖性下调Pgp、MRP1、p-Akt 和CXCR4 的蛋白水平，增强人肺癌A549/DDP 细胞对DDP 的敏感性［41］。

5.2 藤黄酸 通过下调Bcl-2 和p53 的表达促进细胞凋亡，通过抑制P-gp 表达抑制DDP 的排出增加A549/DDP 细胞对DDP 的敏感性。同时，藤黄酸还作为DDP诱导A549/DDP 细胞凋亡的良好增敏剂，通过增加DDP在细胞内积聚和增强DDP 介导的DDP 耐药肺癌细胞凋亡来增强DDP 的作用［42］。

5.3 芹菜素 可逆转A549/DDP 细胞的耐药，可能与降低MDR1 mRNA 转录和下调P-gp 介导的药物外转功能有关［43］。

5.4 雷公藤甲素 可逆转A549/DDP 细胞的MDR，机制可能与抑制Akt/NF-κB 活性，下调MDR1 和LRP 等MDR 蛋白的表达，增加药物在肿瘤细胞内的浓度，从而逆转耐药有关［44］。

5.5 青蒿素 作为NSCLC 耐药的逆转剂，通过阻止P-gp、BCRP 在体内的外排，提高药物在细胞内的浓度，达到逆转耐药的作用［45］。

5.6 防己中的β-sitosterol 通过上调A549/PTX 细胞AR/HSP90 信号通路中的HSP90、KLK3 基因和线粒体/CASP9 凋亡信号通路中的CASP9、CASP3、BCL2、BAX基因，起到逆转NSCLC 的紫杉醇耐药［46］。

5.7 倍半萜类化合物24 从旋覆花中分离出的倍半萜类化合物24 作为抗紫杉醇耐药NSCLC A549/PTX的潜在药物，可以将细胞周期阻滞在G2～M 期，通过线粒体介导的途径诱导细胞凋亡，抑制细胞迁移和侵袭，起到抗肿瘤活性。还可以通过抑制ABC 家族蛋白中的ABCC1，ABCG2 和MDR1 蛋白的表达来逆转MDR［47］。

5.8 黑沙参生果甲醇糖苷提取物 可通过下调JAK1、STAT3、pSTAT3 和MDR1 的表达来抑制JAKSTAT3 信号通路，逆转NCI/ADR-RES 细胞的耐药。黑沙参生果甲醇糖苷提取物可能被用作抗阿霉素耐药癌症的化疗增敏剂［48］。

6 小结

随着分子生物学和相关学科的快速发展，对MDR机制的研究越来越深入，发现新的肺癌MDR 相关靶点已成为可能。由于肿瘤细胞对化疗药物产生耐药是一个复杂的过程，不是单一环节和单个机制的问题，因此，通过单一环节或单个机制逆转MDR 效果多不显著。中药单体成分、提取物及复方在逆转耐药机制上可通过单独或与化疗药物发挥协同作用，降低肿瘤细胞对化疗药物的耐药情况。目前这方面的研究以中药单体为主，复方较少。对包括中药在内的逆转肿瘤耐药药物的研发方面还有大量的工作需要去做。