线粒体自噬在COPD发病机制中作用的研究进展

李忱菲 周新 李锋

1上海交通大学附属胸科医院呼吸科200030;2上海交通大学附属第一人民医院呼吸科200080

COPD是一种以进行性、不可逆气流受限为特征的气道炎症性疾病,主要病理特征表现为肺泡破坏、气道炎症、黏液化生和细胞凋亡[1]。据统计,全球已有3.84亿COPD患者[2],其中47%的患者会出现中至重度呼吸困难[3]。COPD的发病率和病死率居全球第5,病死率在呼吸系统疾病中占比最高,造成了巨大的社会和经济负担[4]。自噬是一种降解受损细胞器和蛋白质的细胞途径,在这一过程中,内质网膜包裹异常的蛋白质及细胞器等融合为自噬体,后与溶酶体融合为自噬溶酶体,从而降解内容物,维持细胞稳态[3]。激活的自噬在COPD的病理生理过程中发挥着重要作用,包括参与黏液分泌过多、气道炎症和肌功能障碍等病理过程[5]。

线粒体是细胞中最重要的细胞器,具有双层膜结构,外膜参与脂质交换、钙离子信号转导等过程,内膜部分向内折叠形成嵴,参与三磷酸腺苷的产生、氧化还原反应和细胞死亡途径的调控。事实上,线粒体的质量控制对于肺部细胞的稳态是至关重要的[6-7],以迅速消除废物,并使其适应呼吸功能对能量的高需求。线粒体质量的控制主要依赖线粒体自噬,即选择性降解受损线粒体的自噬过程。在这一过程中,受损线粒体膜去极化,被周围的自噬体识别,并运输至溶酶体消化降解[8]。越来越多的研究表明,线粒体自噬在COPD的病理生理过程中发挥着重要作用,故本文将线粒体自噬与COPD的关系进行综述。

1 COPD中的线粒体自噬

1.1 线粒体自噬的激活 有丝分裂作为选择性的自噬,是COPD的一种主要的自噬类型。在COPD中,由一系列刺激触发的受损线粒体可分为两个功能不均匀的部分,随后,膜电位下降的子代线粒体被自噬溶酶体清除[9]。这一机制对肺具有特别重要的意义,因为肺对能量供应的需求很高,而且对线粒体功能的依赖性很强。多种信号通路和分子参与识别受损的线粒体以进行选择性降解[10]。线粒体外膜(outer mitochondrial membrane,OMM)的磷酸酶和张力素同源物诱导的激酶蛋白1(phosphatase and tensin homolog-induced putative kinase protein 1,PINK1)和帕金森病蛋白2(parkinson disease 2,PARK2)被认为是2种主要的调节蛋白[9]。一旦线粒体膜电位急剧下降,OMM上的PINK1含量将趋于稳定,同时招募胞浆中PARK2到去极化的线粒体启动自噬。简而言之,PINK1和PARK2能够协同作用检测线粒体的去极化、标记受损的线粒体并触发线粒体自噬[9]。受体通路是另一个启动线粒体自噬的重要途径。OMM上激活的受体包括B细胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)/腺病毒E1B 19 000蛋白-交互蛋白3[11]、Nix(又称BINP3样蛋白,BINP3L)[12]和FUN14区包含1(FUN14 domain containing 1,FUNDC1)[13],此外,自噬和Beclin1调节者1和Bcl-2样13。参与微管相关蛋白1A/1B轻链3B(Microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3B,MAP1LC3/LC3或称LC3)的结合,并通过一系列调控机制触发自噬体吞噬和溶酶体降解[14-15]。由此可见,线粒体自噬是一个由多种因素控制、多种途径协同调控的复杂过程。研究发现,香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract,CSE)诱导COPD患者肺上皮细胞中线粒体膜电位降低,这一结果证明CSE能够引起线粒体功能障碍。与此同时,损伤的线粒体通过激活线粒体动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp1)磷酸化和增加CSE暴露后PINK1的表达,触发了PINK1依赖的线粒体自噬[16]。

1.2 线粒体自噬的保护作用 尽管线粒体自噬是维持肺部功能的重要生理过程,但是,其在COPD中的确切作用仍存在争议。已有研究发现,CSE暴露造成的线粒体损伤,能够引起活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成增加,进而通过加速细胞衰老参与COPD的发病机制[17]。Ahmad等[18]发现,PARK2介导的线粒体自噬是一种保护策略,能够去除线粒体碎片,以防止线粒体损伤的扩散。进一步研究发现,CSE能够通过诱导p53积累并与PARK2相互作用,抑制PARK2异位触发线粒体自噬,进而导致细胞衰老,相反,若在一定程度上增加线粒体自噬将减缓细胞衰老。与此同时,Ito等[17]用低浓度CSE(1%)诱导COPD细胞模型,发现敲除PINK1和PARK2基因可以抑制线粒体自噬,导致细胞衰老加速。以上证据提示,线粒体自噬功能不足参与COPD发病机制,线粒体自噬在COPD中具有一定的保护作用。

最近的研究表明,有丝分裂也可以控制炎症反应。线粒体DNA不适当的有丝分裂能够抑制通过识别Toll样受体9(toll-like receptor 9,TLR9)和激活NOD样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)炎症小体引起的炎症反应[19-20]。IL-1β为COPD发展过程中具有代表性的衰老相关分泌表型因子,就是通过TLR9信号转导和NLRP3炎症小体机制产生和激活的[21-22]。

1.3 线粒体自噬的损伤作用 尽管已经证实,线粒体损伤和去极化能够触发线粒体自噬的激活,但是近来的一些研究发现激活的线粒体自噬也会加重线粒体的损伤和去极化。Mizumura等[16]为探讨PINK1介导的线粒体自噬在体外CSE诱导的上皮细胞死亡中的作用,从PINK1-/-小鼠及其相应的PINK1+/+小鼠分离出肺泡上皮细胞,经CSE(20%)处理后,用乳酸脱氢酶测定细胞毒性,发现与PINK1+/+细胞相比,PINK1-/-细胞对CSE诱导的细胞毒性具有抵抗力。以上结果表明,PINK1介导的线粒体自噬对CSE诱导的细胞死亡具有促进作用。另外,PINK1、受体交互蛋白激酶3和Drp1在COPD肺组织中的表达增加进一步支持了线粒体自噬依赖的细胞凋亡是COPD发病的原因之一[16]。进一步使用线粒体自噬抑制剂Mdivi-1作用于肺泡上皮细胞,发现细胞凋亡受到抑制,肺功能得到缓解[16]。可见,在体外模型实验中,线粒体自噬在COPD发病过程中既有保护作用,又有损伤作用,造成这一矛盾现象的原因可能与实验时采用的CSE的浓度差异有关。

2 线粒体自噬的调控通路

2.1 PINK1-PARK2 PINK1-PARK2是膜去极化线粒体清除的主要通路。PINK1是线粒体丝氨酸/苏氨酸激酶,在正常线粒体中,PINK1含量较低,多数被电压依赖的蛋白酶降解,一旦线粒体受损,线粒体膜去极化,电压依赖的蛋白酶活性受到抑制,膜上的PINK1迅速积累,后招募E3泛素连接酶PARK2进入线粒体,同时介导线粒体底物泛素化,包括Bcl-2、线粒体融合蛋白,与受体蛋白p62/sequestosome-1结合,能够识别噬菌体上泛素化的底物和LC3,最后,噬菌体在LC3介导下包裹受损线粒体,形成自噬体[17,23]。

PINK1是本通路的上游信号,其积累主要依赖线粒体损伤所致的膜电位降低[23],同样,轻度升高的PINK1水平可能一定程度上反映了线粒体损伤[7,24]。Araya等[7]发现PARK2在COPD患者肺组织中表达降低,导致线粒体自噬不充分,这可能是COPD发病机制中的重要部分。PINK1的积累能够招募PARK2,却并不依赖于PARK2的表达。大量的体外实验表明,在PINK1表达降低的情况下,PARK2过表达也足以诱导CSE暴露时的线粒体自噬,导致线粒体ROS产生增加和细胞衰老,相反,PINK1过表达却不能恢复PARK2基因敲除引起的线粒体自噬功能受损[7]。因此,PARK2蛋白表达水平作为PINK1-PARK2通路的下游信号,是该通路介导的线粒体自噬的限速因子。以上结果表明,PINK1、PARK2作为线粒体自噬的关键调控点,在COPD发病中起关键作用,这一发现将成为COPD新的治疗靶点。

2.2 Nix蛋白 Nix最初被认为是Bcl-2家族中仅有BH3结构域的促凋亡蛋白,作为PARK2的底物,可驱动PARK2介导的线粒体自噬,是线粒体选择性清除所必需的[25]。事实上,Nix定位于线粒体外膜,通过调节线粒体外膜透性诱导线粒体自噬引发细胞死亡[26]。该蛋白主要通过驱动线粒体自噬和细胞死亡确保红细胞成熟过程中的线粒体质量。在视网膜神经节细胞和巨噬细胞的分化中也存在Nix介导的线粒体自噬[26]。然而,人们对于Nix在COPD发展过程中气道上皮细胞损伤中的作用依然知之甚少。有研究表明,CSE能增加气道上皮细胞Nix蛋白的表达,从而诱导线粒体自噬,引起细胞死亡[27]。当气道上皮细胞被7.5%的CSE刺激时,Nix的过表达诱导线粒体自噬,加重线粒体功能障碍和细胞损伤。相反,Nix-siRNA能够明显抑制7.5%的CSE刺激气道上皮细胞引起的线粒体自噬,减轻线粒体功能障碍和细胞损伤[27]。然而,Nix介导的线粒体自噬的机制尚不清楚,主要有3种假说模型,(1)Nix触发线粒体去极化,进而导致线粒体自噬和清除;(2)Nix具有一种新的功能,即独立于触发线粒体去极化能力的自噬成分;(3)Nix可以与Beclin-1竞争结合Bcl-2或Bcl-XL,从而增加细胞液中的游离Beclin-1,进一步促进自噬通量[27]。Nix作为介导线粒体自噬的重要受体蛋白,与PINK1、PARK2一致,可以作为COPD治疗的新的研究方向。

2.3 Drp1 线粒体是一个存在动态变化的细胞器,通过融合过程进行结合,同时通过裂变过程进行分裂。线粒体融合由外膜线粒体融合蛋白1、融合蛋白2和内膜视神经萎缩蛋白介导,而Drp1、线粒体分离因子、线粒体分离蛋白1则通过与外膜蛋白结合参与线粒体的分裂[28]。线粒体分裂是线粒体自噬起始的必要条件,Drp1作为线粒体分裂的关键调节因子,对线粒体自噬的触发至关重要。目前为止,Drp1在COPD中的作用尚不明确。有证据表明,Drp1依赖的线粒体自噬可以作为细胞凋亡的上游调节因子,抑制Drp1可部分阻止固有凋亡[29]。Zhao等[29]进一步证实了这一理论,Drp1能够刺激促凋亡蛋白Bax寡聚和细胞色素C释放,这是线粒体外膜通透性增加和凋亡因子释放的必要条件。以上结果表明,Drp1通过细胞凋亡和线粒体自噬参与COPD的发病过程,抑制Drp1有望作为治疗COPD的新途径。

2.4 其他重要蛋白 核纤层蛋白B1可以通过激活雷帕霉素靶点信号通路,触发线粒体自噬,加速细胞衰老[30]。黏液蛋白5AC能够通过介导自噬-JNK-AP-1级联通路,参与CSE诱导的黏液产生[31]。FUNDC1是一种完整的线粒体外膜蛋白,是缺氧诱导的线粒体自噬的受体,该蛋白通过与LC3的相互作用触发线粒体自噬[13]。

3 线粒体自噬抑制剂

3.1 线粒体分裂抑制剂-1(mitochondrial division inhibitor 1,Mdivi-1) Mdivi-1是喹唑啉酮的衍生物,是Drp1的选择性抑制剂[32]。Xu等[33]的研究的结果发现,Mdivi-1抑制促凋亡蛋白Bax的表达,同时上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,提示Mdivi-1具有抗凋亡作用。Mdivi-1治疗还可减轻氧化应激损伤及肺部炎症反应[33]。Mizumura等[16]使用Mdivi-1干预CSE诱导的肺上皮细胞损伤模型和烟草暴露诱导的小鼠COPD模型,发现CSE诱导的线粒体分裂减少,线粒体泛素化和线粒体自噬均被抑制,线粒体外膜去极化也一定程度上有所逆转,这一发现证明Mdivi-1也是线粒体自噬的抑制剂。由于过度的线粒体自噬可以通过促进线粒体损伤参与COPD的发病过程,Mdivi-1作为线粒体自噬抑制剂,可能成为COPD的一种潜在治疗方式。

3.2 莲心碱 莲心碱是一种主要的异喹啉生物碱,具有广泛的生物活性,包括抗心律失常、抗高血压、抗肺纤维化、舒张血管平滑肌等。最新研究发现,莲心碱通过抑制Ras相关蛋白7A招募至溶酶体,阻断线粒体自噬体与溶酶体的融合,有望发展为一种新型线粒体自噬抑制剂并应用于多种疾病的治疗[34]。已有证据表明,莲心碱通过阻断线粒体自噬体与溶酶体的融合,增加线粒体自噬体的积累,从而诱导Drp1的去磷酸化和线粒体易位,加速经典化疗药物阿霉素介导的细胞凋亡,进而增强对体内癌细胞生长的抑制,具有一定的协同抗癌作用[34]。同样是线粒体抑制剂,与莲心碱诱导Drp1去磷酸化和线粒体易位的作用相反,Mdivi-1选择性抑制Drp1,不仅能够拮抗莲心碱的协同抗癌作用,还能在一定程度上治疗COPD。因此,莲心碱的具体作用可能与细胞类型、剂量、时间以及协同药物相关,其在COPD中的作用仍需进一步研究。

3.3 罗氟司特 临床研究表明,磷酸二酯酶4(phosphodiesterase4,PDE4)抑制剂罗氟司特具有治疗效益,特别是对晚期炎症占优势的COPD患者[35]。PDE是环磷酸腺苷或环磷酸鸟苷的特异性酶,广泛分布于人类细胞中[35]。最近的研究发现,罗氟司特能够降低线粒体自噬调节蛋白Drp1和PINK1的表达,表明罗氟斯特对CSE诱导的线粒体自噬依赖的细胞凋亡具有潜在治疗作用[35]。

3.4 QUE CSE诱导支气管上皮细胞进行有丝分裂,导致细胞死亡,该过程不仅引起PINK-1和Drp1表达增加,同时还促进凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-8和caspase-9的表达[36]。实验结果显示,经CSE处理的Beas-2B细胞,caspase-3活性显著升高,而Drp1-siRNA则可使caspase-3活性降低[29]。最新研究发现,QUE通过降低PINK1和Drp1等促分裂蛋白的表达,抑制CSE诱导的线粒体功能障碍和线粒体自噬,减少支气管上皮细胞的凋亡[37]。为探讨QUE对CSE诱导的Beas-2B细胞凋亡的保护作用,Son等[37]检测细胞毒性和细胞形态等凋亡指标,发现5μmol/L的QUE作用于Beas-2B细胞,乳酸脱氢酶释放量明显降低,提示5μmol/L的QUE对细胞凋亡的抑制作用最为显著。由此可见,QUE可能是CSE所致肺部疾病的一种潜在的治疗方法。

4 线粒体自噬增强剂

4.1 Urolithin A Urolithin A是一种新型的线粒体自噬增强剂,主要通过降低线粒体膜电位触发线粒体自噬,具体作用机制与ROS的产生和线粒体呼吸链抑制无关,仍需进一步研究[38]。已有证据表明,Urolithin A对线粒体自噬的增强作用可以通过维持线粒体功能延长生命,且在一定范围内具有剂量反应效应[38]。此外,最新的研究发现,在肌肉与小肠组织中,Urolithin A的线粒体自噬增强作用是保护性[38]。然而,Urolithin A在COPD中的具体作用尚不明确,其与细胞凋亡之间的关系也有待进一步研究。

4.2 苦味受体激动剂 气道重塑是COPD的常见病理特征,表现为气道平滑肌结构和功能改变,常造成严重的支气管收缩。苦味受体激动剂是临床使用的新型支气管扩张剂,主要通过上调Nix的表达和诱导Drp1介导的线粒体断裂和线粒体功能障碍引发自噬,抑制气道平滑肌细胞的增殖[26]。Nix是苦味受体激动剂作用机制的靶点,发挥关键的作用,招募Drp1至线粒体,使线粒体分裂和融合之间的平衡发生变化,分裂增加[27],从而诱导线粒体自噬。Nix表达阴性或Drp1抑制剂Mdivi-1均可抑制苦味受体激动剂诱导的线粒体分裂,逆转线粒体膜电位,促进气道平滑肌细胞的增生[26]。苦味受体激动剂对COPD的病程进展具有一定的抑制作用,但具体的剂量-效应关系仍有待研究。

综上所述,在COPD的病理生理过程中,激活的线粒体自噬可以延缓细胞衰老,也能通过诱导细胞凋亡、增加ROS、损伤线粒体加重COPD,具体作用结果可能与细胞类型、损伤程度等相关。线粒体自噬抑制剂或增强剂作用于线粒体自噬的重要调控靶点,一定程度上具有抑制炎症、改善肺功能等作用,但是,药物选择与剂量、具体作用和机制仍需进一步研究。

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