海南油茶叶片解剖结构与耐热性比较

陈萍，王笃雄，罗健，张健，叶天文，袁德义

1.中南林业科技大学 经济林育种与栽培国家林业局重点实验室，湖南长沙 410004；

2.澄迈乐香种苗管理有限公司，海南澄迈 571900；

3.信阳农林学院园艺学院，河南信阳 465200

油茶是中国特有的木本油料树种，也是海南岛的传统植物资源，海南岛特有的气候环境条件孕育了丰富而具有特色的油茶资源[1-2]。海南种植油茶历史悠久，品质优良，所产茶籽油的口感与品质有别于内地，茶油具有独特的香味，在当地被称为“山柚油”[3-5]，价格较为昂贵。

叶片是植物进行光合作用、呼吸作用和水分交换最主要的器官，对温度、水分、光照等环境因子的反应较为明显[6-7]。一般认为，耐热性较强的植物种具有较大的叶片厚度、栅栏组织厚度、栅海比以及较大的气孔密度，并且关于植物叶片解剖结构与高温胁迫的研究已在杜鹃（Rhododendron simsii Planch）、珙桐（Davidia involucrata Baill）、报春（Primula malacoides Franch）等植物中有相关报道。张腾驹[8]等，采用石蜡切片法、NaCIO 法观察，结果表明珙桐种群植物叶片耐热性主要有栅海比、栅栏组织厚度、气孔密度、下表皮角质厚度、主脉凸起度、上表皮角质层厚度、下表皮细胞厚度等指标；申惠翡等[9]等对杜鹃花通过对叶片电镜扫描对15 个品种叶片的17 项解剖结构研究，利用变异系数、相关分析和聚类分析对杜鹃花叶片解剖结构与其植株耐热性的关系。曾慧敏等[10]研究了28 个八仙花（Hydrangea macrophylla）品种叶片的解剖结构指标进行观察，通过聚类分析及隶属函数的方法研究了八仙花叶片解剖结构与其耐旱性的关系。

有研究表明油茶在0℃以下的长期寒冷，或35℃以上的高温，都会对油茶花造成冻害、灼伤、落花落蕾、花芽无法正常分化。油茶在最高月平均气温为31.0℃，绝对最高气温42.0℃以上，生长便受到抑制，叶片萎靡，果实脱落，甚至死亡，会直接影响油茶的产量和质量[11]。课题组自承担国家林业公益性行业科研专项以来，对海南油茶资源进行了深入调研，发现并收集了一批优质海南油茶资源。通过对收集的种质资源利用高接换冠技术嫁接后发现，不同无性系油茶的耐热性不同，所反映出的生长变化也不同，所以通过探讨油茶叶片组织结构与耐热性的关系，并筛选出耐热性强的种质资源，建立一套完备快捷的耐热性评价指标体系是十分必要的基础工作。因此，研究通过对高接换冠后的海南油茶优质资源的叶片解剖结构特征进行差异比较及相关性分析，将其耐热能力进行综合排序，以期为海南油茶种质资源良种选育和扩繁提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地设在海南省澄迈县福山镇的中南林业科技大学教学实习基地，地处19°56′45″N、109°45′56″E，属热带季风气候，长夏无冬，热雨同季，年平均气温23.8℃。土壤为赤红壤，pH 值为5.0～5.5，且富硒程度高，具备油茶栽培的优良环境[5，12]。

1.2 试验材料

2017 年4 月在该基地应用高接换冠技术对10个海南油茶无性系进行高接换冠，接后2a 基本恢复树势，选取生长旺盛，树冠丰满，无病虫害，株体大小、土壤和光照条件基本一致的植株采集叶片固定保存。

1.3 叶片组织结构观察

采用石蜡切片法[13-14]，乙醇梯度脱水，浸蜡、包埋，Leica RM 切片，切片厚度8μm，番红—固绿双重染色，中性树胶封片。在OLYMPUS-BX53 型显微镜及其成像系统下观察、拍照，采用Image-Pro-plus 软件测量其叶片厚度（Leaf thickness）、主脉厚度（MT）、上表皮角质层厚度（Cuticle thickness of upper epidermis）、下表皮角质层厚度（Cuticle thickness oflower epidermis）、角 质 层 厚 度（Stratum corneum thickness）、上表皮细胞厚度（Thickness of upper epidermis）、下表皮细胞厚度（Thickness of lower epidermis）、栅栏组织厚度（Thickness of palisade tissue）与海绵组织厚度（Thickness of snoopy tissue），计算栅/ 海（P/S）=栅栏组织厚度（TP）/海绵组织厚度（TS）；组织结构紧密度（Tightness of leaf structure）=栅栏组织厚度（TP）/叶片厚度（LT）×100%；组织结构疏松度（Looseness of leaf structure）=海绵组织厚度（TS）/叶片厚度（LT）×100%，变异系数（CV）=（标准差/平均值）×100%[15-16]。每1 植株观察10 张切片，每个制片选3 个视野进行测量，所有数据为30 个视野的平均值。

1.4 气孔观察

采用无色透明的指甲油印迹法制片[17-18]，进行气孔密度测定；在OLYMPUS-BX53 型显微镜及其成像系统下观察、拍照，采用Image-Pro-plus 软件测量气孔长度（Stoma length）及气孔密度（Stoma density）。每个材料观测5 个典型视野中气孔，并求其平均值。

1.5 数据分析

采用Excel 2016 进行数据统计，运用SPSS 21.0 进行单因素方差、差异显著性（P＜0.05）及线性相关关系分析。利用模糊数学中的隶属函数法综合评价10 个海南油茶种质材料的耐热性[19]。

式中：Ri2为每类中第i 类中各项指标的相关指数；n 为每类中的指标个数(i=1，2，3，…，n)；r 为每类中各项指标与同类其他指标的相关系数，指标的相关指数越大，典型性越强。

隶属函数公式为：

式中：f(Xi)为某一种群某一项耐热指标的隶属函数值；Xi为该项耐热指标观测值；Xmax和Xmin分别为10 个种质资源内该项耐热指标的最大值和最小值。

根据上述公式计算筛选出海南不同油茶资源叶片耐热性解剖结构指标的平均隶属度，以平均隶属度评价油茶的耐热性，平均隶属度越大，耐热性越强。同时，参照靳路真等[20]的方法，按照平均隶属度将耐热性分为耐热类型（R）、中耐热类型（MR）、低耐热类型（LR）和不耐热类型（S）。

2 结果与分析

2.1 叶片组织结构比较

2.1.1 叶片生长参数

如表1 所示，试验选择的10 份海南省本地油茶资源，由于生长环境不同，不同油茶资源的叶片形态表现出显著差异（见表1）。MTP-61 的叶长、叶宽、叶面积干重均高于其它无性系，而QZCZ-4 的叶长、叶宽，叶面积干重最低。

表1 10 个海南油茶无性系叶片生长情况比较Tab.1 Comparison of leaf growth of 10 Camellia hainanica materials

2.1.2 叶片厚度比较

叶片厚度常作为植物耐热性指标之一。叶片厚度越大，水分散失越慢，在炎热的环境下可降低水分蒸腾速率，缓解高温对叶片的伤害程度。由表2 可见，10 个海南油茶无性系叶片厚度在340.41μm～457.46μm 之间，平均叶片厚度为394.59μm，最厚叶片与最薄叶片相差117.05μm，变异系数为10.39%，存在极显著差异（p＜0.01）。不同种质材料叶片厚度大小依次为：QZCZ-4＞TCPX-6＞MX-2＞TCPX-7 ＞CMWR-16 ＞BFC-CDL ＞CSC-1 ＞MTP-61 ＞CMJL-6＞QZCZ-3。

表2 10 个海南油茶无性系叶片表皮特征比较Tab.2 Comparison of epidermis characteristics of 10 Camellia hainanica leaves

2.1.3 叶表皮特征比较

表皮是植物的保护组织，是植物抵御外界不良环境的屏障。叶表皮包括上表皮和下表皮。由图1 可见，10 个海南油茶无性系叶片表皮均为单层细胞且呈长方形或者不规则扁长方形排列构成，上表皮细胞比下表皮细胞大，表皮外覆角质层，表皮无毛，表皮细胞垂周壁略呈波浪状。而CMWR-16 中上表皮细胞为规则的扁长方形，排列紧密。由表2 可知，10 个海南油茶无性系的上表皮均厚于下表皮，差异均达到极显著水平。上表皮厚度在25.67μm～45.50μm之间，最厚上表皮是最薄上表皮的1.78 倍，变异系数为18.14%和16.82%，存在极显著差异（p＜0.01）。上表皮厚度和下表皮厚度分别在33.47μm ～20.75μm，其中CMWR-16 上表皮最薄，TCPX-6 最厚，其相应平均值为25.67μm 和45.50μm。下表皮细胞厚度最厚的是BFC-CDL，CSC-1 最薄，其平均值为24.56μm 和14.58μm，其中TCPX-7、TCPX-6，上表皮细胞垂周壁略呈波浪状(图1)；叶片的表皮细胞壁外覆有一层4.91μm～8.08μm 的上表皮角质层和1.79μm～3.87μm 的下表皮角质层，而这种角质层是一层不透水的脂肪性物质，起防止水分散失的作用，通常角质层厚度越大，表明其耐热性越强。不同油茶种质品种角质层平均厚度为1.68μm，MX-2最厚，CSC-1 最薄，变异系数为42.57%

图1 10 个海南油茶无性系叶片横切Fig.1 Cross section of 10 Camellia hainanica leaves

2.1.4 叶片的叶肉特征比较

植物叶片主要通过叶肉组织完成各种生理机能。叶肉组织主要包括栅栏组织和海绵组织，其分化程度可以间接反应植物对外界环境适应的强弱。由图1 可知，海南油茶种质资源叶肉均有明显的栅栏组织和海绵组织的分化，栅栏组织是由紧密的柱状细胞排列，海绵组织主要由排列疏松的椭球和球型细胞形成。对叶肉组织观察（图1），10 个海南油茶无性系的叶肉组织解剖结构存在极显著差异。不同种质资源的栅栏组织厚度的变化范围为84.81μm～179.95μm，其中CMWR-16 最大(179.95μm)，CMJL-6最小（84.81μm）。叶片海绵组织厚度明显大于栅栏组织，且排列较为疏松，其中，TCPX-6 的海绵组织厚度最大为226.87μm，MTP-61 最小为158.24μm。各种群间叶肉组织结构紧密度变化范围为0.24～0.45，CMWR-16 最大，QZCZ-4 最小。

表3 10 个海南油茶无性系叶片解剖结构及气孔比较Tab.3 Comparison of anatomical structure and stomata of 10 Camellia hainanica

2.1.5 叶片气孔特征比较

气孔是植物与外界进行气体交换的孔道和控制蒸腾的结构。一般认为，植物叶片气孔小且密度大的植物在炎热条件下可降低水分损耗。由表3 可知，海南省油茶不同品种的叶片气孔特征存在极显著差异(P＜0．01)。10 个油茶品种叶片的气孔长度在31.03μm ～42.82μm，最大的和最小的分别是MTP-61 和TCPX-7，其平均值为35.41μm 变异系数为10.73%；气孔平均密度为128.50μm，CMJL-6 最大，MTP-61 最小，变异系数为18.58%。

图2 10 个海南油茶无性系叶片下表皮气孔显微结构Fig.2 Stomatal microscopic images in leaf lower epidermis of 10 10 Camellia hainanica

2.1.6 主脉维管束特征比较

主脉维管束主要由机械组织、木质部、韧皮部构成。反映植物对环境中水分和营养条件的适应。各油茶品种的中脉结构如图2 所示，且中脉厚度存在极显著差异(P＜0.01，表3)。中脉厚度从CMJL-6 的478.84μm 到CMWR-16 的706.96μm，最厚中脉是最薄中脉的1.48 倍，变异系数为10.35%。

图3 10 个海南油茶无性系叶片主脉横切面Fig.3 Cross sections of leaf midrib of 10 Camellia hainanica

2.2 不同海南油茶耐热性综合评价

2.2.1 叶片耐热性解剖结构指标筛选

对10 个海南油茶无性系叶片解剖结构进行聚类分析发现（图4），14 项指标距离为10 的时候可分为4 类：第1 类包括8 项指标上表皮厚度、下表皮厚度、角质层厚度、栅海比、组织结构紧密度、组织结构疏松度、下表皮角质层厚度、气孔长度；第2 类为海绵组织和栅栏组织厚度；上表皮角质层厚度、气孔密度为第3 类；主脉厚度和叶片厚度为第4 类。

图4 10 个无性系海南油茶叶片14 项指标的聚类分析Fig.4 Variable cluster analysis of 14 Indexes of 10 Camellia hainanica

表4 叶片结构指标的相关矩阵Tab.4 Correlative matrix of leaf structure parameters

2.2.2 不同油茶品种叶片耐热性评价

根据各指标间相关性分析矩阵（表4）与上述聚类分析图（图4），对相关性的各指标与其耐热性进行综合性分析，可将其分为4 大类种抗热性划分为抗热类型(R，0．550～1．000)有CMWR-16；中度抗热类型（MR，0．500～0．549）有QZCZ-4、CMJL-6、；低抗热类型（LR，0．450 ～0．499） 有BFC-CDL、MX-2；不热类型（S0．400～0．449）TCPX-6、CSC-1、TCPX-7、MTP-61、QZCZ-3。

表5 10 个海南油茶耐热性综合评价Tab.5 Comprehensive evaluation of heat resistance of 10 Camellia hainanica

3 讨论

植物叶片的耐热性反应了植物叶片在光合作用、气体交换以及蒸腾作用后一种特性，而叶片本身形态结构是在自身遗传特性和不断受自然选择而适应环境的结果[21-22]。叶片作为植物体暴露于环境中最大的器官，是对自然界中的光照、水份、温度等主要生态因子的变化较为直观感应[23]。研究学者证明植物解剖结构中的耐热性与叶片厚度、气孔密度、组织结构疏松度、栅栏组织厚度、栅海组织比、上、下表皮角质层厚度、角质层厚度、组织结构疏松度等指标相关[10-12、24-25]；耐热植物的特点之一就是栅栏组织厚度越紧密，海绵组织相对不发达[26]。研究发现耐热性较强的叶片厚度和栅栏组织厚度都较大，发达的栅栏组织能够增强植物的光合作用，也能将水分进行高效运输。

10 个海南油茶无性系的耐热性由强到弱排列为：CMWR-16＞QZCZ-4＞CMJL-6＞BFC-CDL＞MX-2＞TCPX-6 ＞CSC-1 ＞TCPX-7 ＞MTP-61 ＞QZCZ-3。CMWR-16 的耐热性最强，其气孔密度小，栅栏组织、海绵组织发达，叶片厚度大因此叶肉细胞间的侧向接触面积增加，增强了植物在水平方向上的运输能力。同时，中度耐热的CMJL-6 叶片表皮厚度低、组织结构疏松度较高，气孔密度高，利于叶片内部水分利用；而耐热性较差的QZCZ-3、MTP-61，其叶肉组织薄，气孔密度小。但MTP-61 的气孔最长，这可能是因为不同品种（系）在不同环境中采取的耐热机制不同。结合叶片解剖结构发现，CSC-1 的上表皮角质层、气孔密度大，说明其抗旱机制除了增加叶片角质层厚度及叶片中栅栏组织比例外，还包括控制气孔大小和密度；油茶无性系叶片各项指标的大小顺序并不一致，可见在研究耐热性时，不能单凭某一项指标来进行评价［27］。结合海南省的亚热带季风气候特征，为海南省种质资源的选育推广栽培及今后选育耐热性的种质资源提供参考。