模拟海拔5 500 m低压低氧环境对大鼠HPT轴和肠道菌群的影响*

谢亚磊， 梅 颂， 熊艳蕾， 刘诗颖， 徐成丽

((中国医学科学院基础医学研究所/北京协和医学院基础学院， 北京 100005)

平原人快速进入高海拔地区会产生低氧应激，使心脑肺等重要脏器功能、循环和神经系统等发生一系列适应性变化，对低氧应激失代偿时进展为急性高原病，甚至危及生命[1]。诸多研究发现低氧环境下机体神经内分泌系统中下丘脑-垂体-甲状腺(hypothalamus-pituitary- thyroid, HPT)轴通过调节甲状腺激素(thyroid hormone, TH)的合成分泌参与机体各项生理功能的调节。肠道微生物群组成与宿主诸多生理功能密切相关[2]。微生物与宿主在代谢、免疫和内分泌方面的相互作用尤为密切[2]。已有研究发现高原居民肠道菌群中梭菌属、脱硫弧菌属、类杆菌属、乳酸杆菌属和普雷沃氏菌属与平原居民有显著差异[3]。一项以7名登山者为对象的研究发现，海拔5 000 m高度时肠道中变形菌和大肠杆菌的γ细菌等潜在致病菌数量增加，双歧杆菌和阿托波氏菌属，科里氏杆菌属等数量降低[4]。但尚无研究探讨低氧环境下HPT轴与肠道菌群间的联系。肠道微生物能够通过自分泌或者代谢肠道内容物，产生诸多化学物质，如激素、脂肪酸等，通过循环系统参与机体各项生理活动[5]。肠道微生物可能通过调节代谢产物参与宿主生理活动。因此，我们将通过构建低氧动物模型，探究高海拔低压低氧环境下机体甲状腺功能与肠道菌群的变化及两者间关联。

1 材料与方法

1.1 材料

无特殊病原菌级SD健康成年雄性大鼠，体重(321±13)g，10周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号：SCXK(京)2016-0006]。饲养环境为自然光照，温度为(20±4)℃，湿度为30%～60%，全价大鼠维持饲料购自北京科澳协力饲料有限公司，饮用自来水，自由饮食。大鼠随机分组为常氧对照组和低氧实验组，共计16组大鼠，每组8只。大鼠血清HPT轴激素水平使用武汉CUSABIO公司的TRH(CSB-E08040r)、TSH(CSB-E05115r)、TT4(CSB-E05082r)、TT3(CSB-E05085r)、FT4(CSB-E05079r)和FT3(CSB-E05076r)试剂盒检测。大鼠肠道菌群DNA使用德国QIAGNE公司PowerFecal DNA Kit(12830-50)试剂盒提取。肠道菌群16s rDNA测序由北京诺禾致源科技股份有限公司采用Illumina Hiseq技术测序平台完成。

1.2 低氧动物模型的构建

低氧组大鼠被放置于低压低氧模拟舱(贵州风雷航空军械有限公司，FLYDWC50-IIC)，以平均9 m/s的速度升至海拔5 500 m(空气O2含量10%，379 mmHg)，根据实验设计模拟不同时间的持续低氧(1，3，7，14，21和28 d)，1 d和3 d恢复组(1-R、3-R)分别为持续低氧1 d和3 d后常氧恢复一周。持续低氧期间，每天固定时间开舱20 min，进行饮食添加、更换垫料、记录体重和摄食。对照组大鼠饲养于常氧环境(北京，海拔52 m，气压760 mmHg)。

1.3 动物组织样品采集

持续低氧结束后，各组随机选择6只大鼠取样。戊巴比妥钠水溶液腹腔注射麻醉。麻醉彻底后，迅速开腹，取直肠末端大便，置于冻存管中液氮冻存。心脏采血并离心分装血清，-80℃保存。ELISA检测大鼠血清甲状腺激素水平。

1.4 肠道菌群16s rDNA测序与分析

提取大鼠肠道菌群DNA，以16S rDNA的V4区为待测序区域，进行文库构建，上机测序(北京诺禾致源科技股份有限公司，Illumina Hiseq技术测序平台)。整理测序数据后，得到最终有效数据。肠道菌群物种注释通过QIIME软件(version 1.9.1)分析，以97%的一致性聚类为OTUs(Operational Taxonomic Units)。对OTUs代表序列与Greengene数据库(http://greengenes.secondgenome.com/)比对并进行物种注释，并根据物种注释结果，统计肠道菌群相对丰度。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 实验期间大鼠体重及摄食量监测

大鼠体重和摄食量的监测显示，与常氧组相比，各低氧组大鼠低氧1 d后体重显著下降(P<0.01)，进食明显减少。动态监测28 d组大鼠体重及摄食量发现，随低氧暴露时间延长，低氧组大鼠体重及摄食量逐渐增加，但仍显著低于对照组。低氧恢复组大鼠体重及摄食量常氧7 d后恢复至对照组水平。各组大鼠体重及摄食量变化如表1所示。

Tab. 1 Weight and food intake of SD rats after different hypoxia exposure times (g, n=8)

2.2 模拟海拔5 500 m环境对大鼠HPT轴激素的影响

大鼠HPT轴激素水平检测显示，与常氧组相比，1、3、14、21和28 d低氧组TRH显著降低(P< 0.05)，1 d和3 d恢复组则有所恢复；1和28 d低氧组TSH显著下降(P<0.01)。1、14和28 d低氧组TT4及TT3显著增加(P<0.05)。1 d恢复组TT4未恢复、TT3恢复。3 d低氧组TT4显著降低(P< 0.01)且可恢复。21 d低氧组TT4显著增加(P< 0.01)。1 d低氧组FT4及FT3显著增加(P< 0.05)，7 d低氧组显著降低(P<0.05)。1 d恢复组FT4恢复。低氧1 d恢复组FT3含量显著低于对照组水平(P<0.01)，3 d低氧恢复组FT3含量显著高于对照组(P<0.05)，其余指标无显著差异。HPT轴激素含量如图1所示。

Fig. 1 Effects of hypobaric and hypoxia environment at the simulated altitude of 5500 m on serum HPT axis hormones in n=6)

2.3 模拟海拔5 500 m环境对大鼠肠道菌群的影响

大鼠肠道菌群的鉴定，共鉴定出330个菌属，相对丰度具有显著性差异(P<0.05)的菌属共计12个，如图2所示。与常氧组相比，各低氧组副拟杆菌属丰度显著增加(P<0.05)，1 d恢复组未恢复，3 d恢复组恢复。1 d低氧组乳酸杆菌属丰度显著增加(P<0.05)，且恢复组完全恢复，7、14和21 d低氧组显著降低(P<0.05)。球毛菌属、阿克曼氏菌属丰度在低氧14、21和28 d后显著增加(P<0.05)。迷踪菌属丰度在低氧7、14、21和28 d后显著增加(P< 0.05)。丁酸球菌属、拟杆菌属、臭味杆菌属和RC4-4菌属丰度在低氧1天和3 d后显著增加(P<0.05)，且1和3 d恢复组丁酸球菌属及臭味杆菌属丰度可恢复。拟杆菌属丰度仅3 d恢复组可恢复，RC4-4菌属丰度仅1 d恢复组可恢复。21 d低氧组丁酸球菌属丰度显著增加(P<0.05)；28 d低氧组臭味杆菌属丰度显著增加(P<0.05)。萨特氏菌属丰度仅在低氧14 d后显著降低(P<0.01)。普氏菌属丰度仅在低氧3 d及28 d后显著降低(P<0.05)。[普氏菌属]丰度在低氧3 d后显著降低(P<0.05)，低氧28 d后显著增加(P<0.05)，1 d和3 d恢复组仍显著高于对照组(P<0.01)。

2.4 模拟海拔5 500 m环境下大鼠血清HPT轴激素与肠道菌群相关分析

分析低氧组大鼠12种存在显著差异的肠道菌属与大鼠血清HPT轴激素的相关性，结果如图3所示。阿克曼氏菌属与TRH显著负相关(r=-0.37,P=0.01)，与FT4显著正相关(r=0.516,P<0.01)。拟杆菌属与FT4显著负相关(r=-0.305,P= 0.035)。丁酸球菌属与TRH和TSH显著负相关(r=-0.596,P<0.01;r<-0.474,P<0.01)。乳酸杆菌属与TRH和TSH显著正相关(r=0.57,P<0.001;r=0.472,P=0.01)，与FT4显著负相关(r=-0.296,P=0.041)。臭味杆菌属与TT3显著负相关(r= -0.287,P=0.048)。副拟杆菌属与FT4显著正相关(r=0.313,P=0.030)。RC4-4与TSH和TT3显著正相关(r=0.416,P=0.003;r=0.414,P= 0.003)。普氏菌属与TSH显著负相关(r=-0.328,P=0.023)。迷踪菌属与TRH和TSH显著负相关(r=-0.35,P=0.015;r=-0.483,P=0.01)。萨特氏菌属与TRH和TSH显著负相关(r=-0.314,P=0.03;r=-0.327,P=0.023)(图3见彩图页Ⅲ)。

Fig. 2 Effects of hypobaric and hypoxia environment at the simulated altitude of 5500 m on serum HPT axis hormones in rats n=6)

3 讨论

大鼠体重和摄食量均在模拟海拔5 500 m环境下第1日后显著下降。随低压低氧时间的延长，体重及摄食量逐渐增加，但仍低于对照组，说明低压低氧引起大鼠体重下降。1 d和3 d急性低氧后，再在常氧环境中恢复7 d，体重及摄食量能够恢复至常氧对照组水平，说明急性低氧引起的体重降低能够在常氧环境中恢复。体重的降低是由于低氧环境下静息代谢率增加导致的能量失衡，而静息代谢率的增加与低氧应激时交感神经系统活性增加及甲状腺功能亢进有关[6]。静息代谢率是指机体在静息状态下维持正常生理功能所需能量。除能量消耗增加外，低压低氧环境中神经内分泌系统变化导致的食欲降低也同样导致体重的下降[7]。

血清HPT轴激素检测结果提示，急性低压低氧环境使大鼠甲状腺功能处于亢进状态，FT3、FT4和TT3、TT4水平均显著增加，TSH和TRH水平则由于HPT轴的负反馈调节而显著下降。急性低氧恢复组数据说明，急性低氧后大鼠可在常氧环境中恢复至正常对照组水平。随着低氧时间延长，大鼠逐渐习服低氧环境，甲状腺激素水平也逐渐恢复至对照组水平。HPT轴中TRH、TSH、TT4和TT3含量也在低氧7 d后逐渐恢复至对照组水平。慢性低氧暴露组TRH和TSH含量显著低于对照组，而TT4和TT3含量显著高于对照组，FT3和FT4与对照组相比则无显著差异，说明大鼠逐渐适应低氧环境，甲状腺功能亢进状态逐渐恢复。慢阻肺患者长期低氧对下丘脑和垂体存在抑制作用，而血清T3和T4含量则正常[8]。模拟海拔6 900 m低氧5周的大鼠实验发现，血清TSH显著升高，T3和T4含量显著下降[9]。

副拟杆菌属是肠道菌群中主要菌属之一。其丰度与肥胖负相关，与脂肪组织产热增加、肠道完整性增强、炎症和胰岛素抵抗水平降低有关[10]。低氧组副拟杆菌属丰度均显著增加，可能与大鼠体重降低和维持肠道屏障有关。拟杆菌属是哺乳动物肠道菌群重要组成部分，通过分泌胆汁酸盐水解酶参与胆汁酸代谢，有助于降低血清胆固醇，参与宿主免疫调节[11]。急性低氧组拟杆菌属丰度均显著增加，可能与大鼠急性低氧应激下免疫调节有关。RC4-4为蛋白胨球菌科，其丰度与循环水平氨基酸、胆碱显著负相关，与胆固醇、脂肪酸显著正相关[12]。低氧组RC4-4菌属丰度均显著增加可能参与大鼠代谢调节。丁酸球菌属产丁酸、异丁酸，属于紫单胞菌科。二甲双胍能显著增加高脂饮食肥胖模型小鼠肠道中丁酸球菌属丰度[13]。该菌属可能影响大鼠在低氧环境下的代谢调节。臭味杆菌属属拟杆菌门，产丁酸盐，代谢综合征患者肠道中丰度显著降低[14]。低氧应激引起的臭味杆菌属丰度显著增加同样可能参与大鼠代谢调节。普氏菌属在肠道菌群中占比较大，与植物性饮食相关[15]，其丰度增加与高纤维饮食介导的糖代谢改善有关。低氧环境人体肠道中普氏菌属丰度显著降低[16]。本实验结果与上述研究一致。

萨特氏菌属为变形菌门，代谢综合征患者中丰度较高，与总胆固醇显著正相关，与丁酸盐和改善肝损伤的鲨烯和硬脂酸显著正相关，促进糖尿病症状改善[14]。其丰度仅在14 d低氧后显著降低，其他各低氧组均无显著差异，由散点图推测可能是对照组存在极端值所致。阿克曼氏菌属为疣微菌门，参与维持肠道屏障完整性，是已知益生菌，影响葡萄糖代谢、脂质代谢和肠道免疫[17]。已有研究发现阿克曼氏菌属为高海拔地区藏羚羊肠道菌群中优势菌属[18]。乳酸杆菌属和阿克曼氏菌属相对丰度的变化与低氧应激时间有关。乳酸杆菌属为已知重要益生菌，慢性低氧大鼠模型(氧含量10%，低氧21 d)肠道乳酸杆菌丰度显著降低，与本实验研究结果一致[19]。而另一项以低氧暴露30 d(每日低氧8 h)大鼠为对象的研究则发现肠道中乳酸杆菌属丰度显著增加[20]。该结果可能与大鼠低氧暴露时间较短有关。球毛菌属为螺旋体科，生长发育迟缓的小牛被补充益生菌后，该菌属丰度显著增加[21]，尚未发现低氧相关报道。迷踪菌属是迷踪菌门中唯一已知菌属，仅E.minutum1个菌种，被认为是益生菌，可以改善肠道菌群的失调[22]，尚未发现低氧相关报道。本实验研究发现慢性低氧组大鼠球毛菌属和迷踪菌属相对丰度显著增加。

相关性分析发现低氧环境下大鼠肠道菌群中已知显著差异菌属与血清中HPT轴激素存在显著相关性。有研究发现，通过放射性碘摄取分析显示，经抗生素处理的大鼠的甲状腺功能降低[23]。与正常肠道菌群的小鼠相比，无菌小鼠TSH显著增加[24]。甲状腺功能减退的桥本氏甲状腺炎患者肠道中拟杆菌属丰度显著增加，普氏菌属丰度显著降低[25]。但是菌属丰度变化与该研究中高浓度TSH和低浓度TT4、TT3的相关性并没有被揭示。以甲状腺癌和甲状腺结节患者为对象的研究发现，与健康对照相比，患者肠道中普氏菌属显著增加，丁酸球菌属、拟杆菌属、乳酸杆菌属和萨特氏菌属显著降低，且FT3与拟杆菌属和乳酸杆菌属显著负相关[26]。相关性结果提示肠道菌群可能通过影响代谢产物进而影响宿主甲状腺功能，但是具体分子调节机制仍需进一步探索。