桑叶生物碱测定方法研究进展*

吴晓红，高生平，陈媛媛，蒋彩云，张汉鹏，刘敬华

(1 江苏经贸职业技术学院，江苏 南京 211168；2 南京工业大学浦江学院，江苏 南京 211134)

在我国，桑树自古以来就有较大范围的种植和利用，是我国农耕文明的重要代表作物。桑树广泛分布在包括新疆地区在内的我国28个省区，享有“东方圣树”的美称。桑叶是药食两用品，传统中医理论中桑叶素有疏散风热、清肺润喉、清肝明目、滋阴补血之功效。现代药理研究证明，桑叶中多羟基生物碱类具有明显的降血糖、降血脂作用[1-2]。桑叶中含有多种生物碱成分[3]，1-脱氧野尻霉素 (1-deoxynojirimycin，DNJ)是桑叶中多羟基生物碱的一种特征性成分，近些年来深受研究学者们关注，是一种糖苷酶抑制剂[4-6]。

桑叶中总生物碱的含量受桑叶品种、采摘时间、产地和药用部位等多种因素影响[7]，准确快速测定桑叶中的总生物碱和生物碱单体含量，为桑叶的制剂质量控制及药用价值进一步开发提供依据。本文拟对近年来国内学者就桑叶生物碱测定方法的研究现状进行综述。

1 桑叶生物碱的提取方法

生物碱的诸多价值吸引着广大研究人员寻找合适的生物碱提取方法。桑叶生物碱的多羟基结构，使得在极性溶剂中溶解性较强。常规提取溶剂为水和乙醇，为增加提取效率，有报道采用酸水[8]、亚临界水[9]、纤维素酶水溶液[10]等提取溶剂，提取方法采用煎煮提取[11]、加热回流[12]、超声辅助[13-15]、微波辅助[16-17]、真空气流细胞破壁[18]等提取技术。

水提法虽能够提取大部分生物碱，但水溶性杂质过多，提取液需要进一步分离纯化，通常需要加入乙醇沉淀除去桑叶多糖类物质的干扰。有机溶剂提取法适用性较强，不过也存在着提取纯度不高、较为耗时的缺点。有文献[19]报道通过加热回流的方式提取桑叶中的DNJ会造成其结构破坏，所测含量偏低。随着新技术的应用，超声提取、微波萃取等都呈现了较好的提取效果。真空气流细胞破壁技术结合有机溶剂提取法可以大幅度提升生物碱的得率[17]。

2 桑叶生物碱的检测方法研究概况

2.1 高效液相色谱法

2.1.1 高效液相色谱-紫外检测器法

紫外检测器是液相色谱最常用的检测器，该法要求被测物质要带有发色团。而桑树生物碱本身不吸收紫外光，需要衍生化反应生成能吸收紫外光的物质。唐静等[20]采用柱前衍生化高效液相色谱-紫外检测器法，以芴甲氧羰酰氯为衍生化试剂，以C18柱为色谱柱，检测了桑叶中DNJ的含量，该方法操作简便，结果准确，解决了DNJ无紫外吸收难以检测的困难。刘韦鋆等[11]建立了柱前衍生化高效液相色谱法测定桑叶中DNJ的方法，流动相为乙腈-0.1%冰醋酸(11：16)，检测波长为254 nm，并进行了方法学验证。

2.1.2 高效液相色谱-荧光检测器法

荧光检测器是一种选择性好、灵敏度极高的检测器。但由于桑叶生物碱本身不发荧光，仍需要进行衍生化反应后测定。欧阳臻等[21]就针对桑叶DNJ采用了荧光检测法。桑叶经酸法提取后，使用芴甲氧酰氯处理样品发生衍生化反应，以激发波长为254 nm，发射波长为322 nm，流动相为乙腈-0.1%乙酸水溶液(55：45)。实验结果显示该法加样回收率达到了97.2%。徐斌等[22]在前人基础上采用柱前衍生高效液相色谱-荧光检测器法对22种桑叶中DNJ的含量进行了测定，改进了色谱分离条件，色谱流动相为乙腈-0.1%乙酸水溶液，以梯度洗脱的方法达到更好的分离效果。

2.1.3 高效液相色谱-二极管阵列检测器法

二极管阵列检测器与紫外检测器相比，一次检测可以得到各组分的光谱、色谱的三维谱图，为后续的定性、定量分析提供了更多的依据，但测定桑叶生物碱类化合物仍需衍生化反应后进行测定。高林森等[22]利用该法检测了桑叶中DNJ含量。以酸法提取纯化后的DNJ，在弱碱性介质中与芴甲氧酰氯发生衍生化反应，265 nm为测定波长，采用C18色谱柱，分析发现目标色谱峰分离效果好，精密度、稳定性、重现性、回收率的测定结果均显示该法稳定可靠。

2.1.4 高效液相色谱-示差折光检测器法

示差折光检测器是通用型检测器，优点是不需要样品有光学特性，缺点是灵敏度比其它检测器差。欧阳华学等[23]建立了高效液相色谱-示差折光检测法直接测定桑叶中DNJ的方法，以强极性氨基键合硅胶为固定相的色谱柱，以乙腈-水(70： 30)为流动相，取得了满意的效果。该法最大的优点是样品不需衍生，具有操作简便、快速、准确的特点，但由于示差折光检测器的灵敏度低，该法应用不多。

2.1.5 高效液相色谱-蒸发光散射检测器法

蒸发光散射检测器响应值不需要样品具有光学特性，因此检测时避免了其它检测器需要样品带有发色团或荧光基团的限制条件，应用范围较广。但该检测器的灵敏度较低，干扰较大，测定误差大。杨梅等[24]采用该法测定了不同产地的桑叶中DNJ的含量分布，流动相使用乙腈-水(70：30)混合液，并加入10 mmol/L醋酸铵溶液。平均回收率达95.98%，RSD为1.98%。王贺等[25]采用该法，以乙腈-水(85：15)为流动相，测得新疆药桑叶中DNJ平均含量为1.93 mg/g。实验结果表明该方法快捷简便、结果可靠。

2.1.6 高效离子交换色谱-脉冲安培检测法

Yashihashi等[26]开发了一种简单、选择性强、快速的高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测方法，用于定量测定桑叶产品中的DNJ。将桑叶茶样品的水提取物在CarboPac MA1色谱柱中以NaOH溶液梯度洗脱进行测定。DNJ保留时间为7.26 min，检出限为5 ng。该法干扰小，对DNJ具有高选择性，并且在样品制备、分离度和灵敏度方面优于其它高效液相色谱技术。

2.2 液相色谱-质谱联用法

质谱法是一种通过测量离子荷质比来区分不同成分的方法，通常与分离技术联用以取得更好的效果。沈小月等[27]采用液相色谱-质谱联用法检测分析了桑叶生物碱成分，衍生化后分离并对照鉴定。对4个生物碱成分(含DNJ和荞麦碱)进行检测和鉴定，取得了良好的效果。

通过一级质谱只能测定组分的分子量；而对于分子量相近的，结构又相互区别的复杂混合组分，传统的单一质谱功能不能满足分析要求。利用多级串联质谱技术，对上一级质谱图的信号强或关键的信号峰，选作下一级的母离子来进一步分析，一直检测2～3级。尚磊等[28]采用液相色谱-串联质谱法检测了桑叶中总生物碱成分，以DNJ为参照，外标法计算桑叶总生物碱含量。此方法可检测出样品中的6种生物碱，包括DNJ、荞麦碱等，总生物碱含量超过75%。Zhang等[29]用超高效液相色谱-串联质谱法，一次分离并且检测出了桑叶中的DNJ和荞麦碱的含量。

2.3 硅钨酸盐沉淀法

该法也称为沉淀重量法，用于测定桑叶总生物碱含量，具有操作简单、快捷、不需要复杂仪器、不需要使用昂贵对照品等优点。该法原理是采用生物碱沉淀试剂硅钨酸与桑叶总生物碱产生沉淀，称量此沉淀重量，换算出生物碱含量。邓海波[30]用沸水提取桑叶，提取液经纯化处理后得总生物碱，用重量法测定其生物碱含量为27.1%。刘一衡[31]采用该法测定了新疆药桑桑叶总生物碱含量，在正交试验优化出的最佳实验条件下得到总生物碱含量为4.64 mg/g。何军等[32]比较了紫外分光光度法和重量沉淀法在测定附子总生物碱含量中的差异，发现重量沉淀法准确性、稳定性要优于紫外分光光度法。

2.4 雷氏盐比色法

雷氏盐比色法也常用于测定总生物碱含量。桑叶经提取纯化后供试品溶液在酸性介质中与雷氏盐反应，生成不溶于水的生物碱雷氏铵盐沉淀，经处理后，用70%丙酮溶液溶解，于525 nm附近测定其吸光度。沈维治等[33]采用该法测定了桑叶中总生物碱含量。结果显示，不同桑树品种、不同生长时期及不同部位的桑叶中总生物碱含量存在差异。蒲俊松[34]采用该法测定了桑叶总生物碱的含量，该方法操作简单，稳定性好，回收率高，能克服传统方法中繁琐、仪器设备昂贵等缺陷和不足。

2.5 气相色谱法

气相色谱法常用于热稳定性比较好、沸点较低的样品，桑叶中DNJ不易汽化，需要衍生化后测定。李宏等[35]为测定DNJ的含量，通过预处理将样品反应制得沸点较低的酯类物质，首次将气相色谱法应用到了桑叶DNJ的检测上。王济强等[36]将桑叶生物碱提取液中的DNJ与六甲基二硅氮烷和氯化三甲基硅烷发生衍生反应，所得产物使用TRB5色谱柱进行分离，气相色谱-质谱法定性，火焰离子化检测器定量分析DNJ含量。该法采用气相色谱-质谱法对硅烷化衍生物目标峰进行了确定，简单、快速、准确。

2.6 薄层色谱法

杨翠平[37]确定了DNJ测定的薄层色谱法定性分析条件，对比了几种常用的定性检测生物碱的显色剂和展开剂。实验结果发现，以正丁醇-醋酸-水(4：1：1)为展开剂，氯-邻联甲苯胺为显色剂，DNJ在薄板上的展开效果最好，DNJ斑点圆整、清晰。

李玲等[38]建立了新疆药桑叶中DNJ的薄层色谱定性鉴别方法，以正丁醇-冰醋酸-水(4.5：1.2：1.2)为展开剂，在高效硅胶 G 薄层色谱板上展开，氯-联甲苯胺为显色剂，分离度好、斑点清晰，可作为药桑叶定性鉴别指标。

2.7 实时直接分析离子源串联质谱法

直接实时分析电离源是近年来出现的一种新型非表面接触型热解析大气压电离源，具有操作简便，可以对样品进行直接、无损、快速、原位分析等特点。徐斌[39]首次采用该法串联质谱对桑叶中的DNJ进行了定量分析，并鉴定了桑叶中的荞麦碱。将所测得结果与液相色谱-荧光检测器法测得结果进行对比，发现两组数据的吻合度令人满意，说明实时直接分析离子源串联质谱法是一种有效、准确的、可用于定量桑叶中DNJ的分析方法。

3 结 语

近些年来，人们对桑叶活性成分的研究兴趣大增，极大地促进了桑叶的药用价值和营养价值的进一步开发，特别是具有治疗糖尿病作用的桑叶生物碱。用于测定桑叶总生物碱的重量法和比色法所用仪器简单，易于操作。薄层色谱法一般仅用于定性鉴定DNJ，而液相色谱法可选择多种类型检测器，常用于测定生物碱单体，应用最广泛。液相色谱-质谱联用法定性定量分析生物碱成分较为准确，但检测成本高。气相色谱法需要将生物碱衍生化方能进行测定，应用不多。随着研究的深入，对生物碱种类、结构和性质的了解越来越多。新仪器分析技术的应用提高了检测效率，多种分析方法的联合使用更是大大提高了检测准确度。可以预见将来还会涌现出更多新技术应用于桑叶生物碱的检测，有助于桑叶药用价值的开发。