百宜黑鸡PRL基因多态性与产蛋性能关联分析

韩 雪，伍革民，吴松成，陶宇航，朱丽莉，粟朝芝

(贵州省畜牧兽医研究所，贵州 贵阳 550005)

在鸡的繁殖性能基因研究中，已有不少相关基因被报道，催乳素(PRL)基因就是其中1 种。 PRL 是垂体前叶嗜酸性细胞分泌的由单基因编码的23 ku 多肽类激素[1]，具有促进哺乳动物泌乳、调节卵巢发育、维持妊娠和家禽就巢行为、调节内分泌等功能[2，3]。目前对于PRL基因在家畜上的研究报道较多，但在家禽上的报道较少。 常明雪[4]对文昌鸡PRL基因多态性进行研究发现，该基因多态性对产蛋性能有显著影响；洪坤月等[5]研究报道，PRL基因多态性对太湖鸡前期产蛋性能并无影响(P＞0.05)。 本试验以百宜黑鸡为研究对象，旨在探究百宜黑鸡PRL基因与产蛋性能的相关关系，为该品种的选育提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料随机选取日龄及饲养管理水平相同的百宜黑鸡95 只(由贵州省农农农生态农业发展有限公司种鸡场提供)，翅静脉采血5 mL，EDTA 抗凝，冰盒带回实验室，-20 ℃冰箱保存备用。

1.2 基因组DNA 提取采用血液/细胞/组织基因组DNA 提取试剂盒(北京天根生物有限公司) 提取百宜黑鸡血液中基因组DNA，并用微量紫外分光光度计对所获得的DNA 进行浓度和纯度测定，1.0%琼脂糖凝胶检测其完整性。

1.3 引物设计及PCR 扩增根据 NCBI 发布鸡PRL基因序列(GenBank：NC_006089.4)，利用引物设计软件Primer 5.0 对鸡PRL基因设计5 对特异性引物进行全部外显子扩增，引物由上海英骏科技有限公司合成，引物信息见表1。 PCR 扩增反应采用30 μL 体系，引物浓度 10 μmol/L：上游引物 2 μL，下游引物 2 μL，DNA 模板 3 μL，2×TaqPCR Master Mix(北京天根生物有限公司)14 μL，双蒸水 9 μL；95 ℃预变性 5 min；95 ℃变性 40 s，退火 35 s(退火温度见表1)，72 ℃延伸 40 s，32 个循环；72 ℃终延伸10 min。

表1 鸡PRL 基因扩增引物信息

1.4 数据处理使用Excel 2007 对数据进行分类统计，DNAstar 进行序列分析、比对，调用SPSS 18.0中的GLM 模型对不同基因型与总蛋个数、蛋均重2 个产蛋性状间的关联性进行相关分析，结果以“平均数±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 PCR 产物检测结果由图1 可见：5 对引物扩增的目的条带与预期结果一致，且引物特异性良好，可用于测序。

2.2 PCR 产物测序及序列分析根据目的片段扩增结果，将PCR 产物全部送往北京诺赛基因组研究中心有限公司心进行测序。 测序结果经DNAstar 拼接并与GenBank 发布的鸡PRL基因序列进行校正、比对，结果在试验群体的PRL基因中发现存在4 个SNPs(见图2)，分别为g.6171 C＞T、g.6232 C＞G、g.6306 C＞T、g.6440 T＞C，且 4 个 SNPs 均在第 5 外显子。

2.3 鸡PRL 基因遗传特性分析测序结果经序列对比发现，在试验群体的PRL基因中找到 4 个SNPs，根据4 个SNPs 对应的突变位置将它们分别对应的纯合子和杂合子命名为CC、CT、TT；CC、CG、GG；CC、CT、TT；TT、TC、CC 型。 根据表2 统计结果可知，不同 SNPs 对应的基因型中 TT、GG、CC、TT 基因型为优势基因型；此外，g.6171 C＞T 和g.6232 C＞G 是属于完全连锁平衡位点。 χ2适合性检验表明，该基因座上的所有突变位点均不处于Hardy-Weinberg 平衡状态(P＜0.05)；除了 g.6306 C＞T 位点的PIC=0.177 3＜0.25 属于低度多态，其余位点PIC值均大于0.25 小于0.5，属于中度多态。

表2 鸡PRL 基因多态位点基因型频率及等位基因频率

2.4 PRL 基因与产蛋性状关联分析由见表3 可见，根据SNPs 分型的结果，对不同基因型与总蛋个数和蛋均重关联性进行分析，结果发现各SNP 位点与这2 项生产数据之间不存在显著相关性(P＞0.05)。

表3 PRL 基因多态位点与产蛋性状关联分析

3 讨论

3.1 以前对于家禽PRL基因存在1 个误区，即认为家禽并不产乳，因此PRL基因在家禽中是不存在或者是不表达的。 2005 年，Kansaku N 等[6]对鸭的PRL基因cDNA 进行克隆，并对序列进行分析发现，调节PRL基因表达的机制可能在鸟类中广泛存在，也即是说PRL基因在家禽中是能够表达的。 王建等[7]报道，PRL基因在鹅产蛋期的垂体、下丘脑和卵巢组织中的表达量均显著高于未调控处于正常休产期的对照组，由此说明PRL基因在鹅品种中是能正常表达的。 赵文明[8]等研究发现，PRL基因调控区的多态性对不同鹅品种早期增重和屠宰性状都有显著影响(P＜0.05)。 李慧芳等[9]报道，仅在高邮鸭PRL基因第1 内含子1 326 bp 发现了T/C 突变，并且这个位点突变与高邮鸭蛋重呈极显著相关(P＜0.01)、与双黄蛋率呈显著相关(P＜0.05)。 张学余等[10]研究显示，PRL基因PRL 调控区的多态性对白耳鸡产蛋数有显著影响。

3.2 本研究以百宜黑鸡为研究对象，对百宜黑鸡PRL基因的全部外显子进行扩增、测序验证，筛选SNP 位点，结果在试验群体共发现4 个SNPs，且这4 个位点均处于第5 外显子区域，进行遗传参数相关分析发现，该基因座的几个位点均不处于Hardy-Weinberg 平衡状态，这有可能是遗传漂变所造成，也有可能是采样误差造成，更有可能是集约化生产管理中人工过度干预选育所造成，这有待于下一步扩大样本数量进行验证。 将各SNP 位点与百宜黑鸡产蛋数和平均蛋重进行相关分析发现，各SNP 位点与这2 项产蛋性状之间均不呈显著关系，这可能是品种间的差异造成，或者是PRL基因外显子区域的多态性对产蛋性状无影响，也有待于进一步扩大样本数量、涉及更多生产性状进行研究。

4 结论

通过对百宜黑鸡PRL基因多态性进行筛选，共发现4 个SNPs，均处于第5 外显子，其中g.6171 C＞T 和g.6232 C＞G 位点之间属于完全连锁平衡；各SNP 位点与总蛋个数、蛋均重2 项产蛋性状间无显著相关关系。