五倍子瘢痕膏对瘢痕疙瘩miR-21/mTOR信号通路相关分子表达的影响

唐志铭，翟晓翔，丁继存，荆梦晴，管志强，李永聪

（1.徐州市中医院，江苏徐州221003；2.上海市第七人民医院，上海200137；3.徐州市中心医院，江苏徐州221009；4.徐州市第一人民医院，江苏徐州221002）

目前瘢痕疙瘩的的发病机制甚多，但是其确切发生机制至今尚未完全阐明，且其防治也没有取得突破性进展。中医药防治瘢痕疙瘩有着悠久的历史，并且积累了许多宝贵的经验与方法。本课题组应用五倍子瘢痕膏治疗瘢痕疙瘩疗效确切[1]，前期实验研究证实其能抑制疤痕疙瘩成纤维细胞增殖[2]，但其具体作用机制尚不清楚。近几年来微小RNA（microRNA，miRNA，miR）在瘢痕疙瘩发生中的作用日益受到重视，对其深入的研究有望为瘢痕疙瘩的防治提供崭新的思路和手段。有研究者应用基因芯片技术证明miRNA在病理性瘢痕与正常皮肤组织中存在着差异性表达[3-4]，其中miR-21在增生性瘢痕组织中表达显著高于正常皮肤组织[5]。miR-21的一个靶基因是10号染色体张力缺失蛋白磷酸酶（PTEN），而PTEN是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路的一个重要负反馈调控因子。那么五倍子疤痕膏抑制疤痕疙瘩成纤维细胞增殖是否与其干预miR-21/mTOR通路有关呢？为证实这一推测，本研究检测瘢痕疙瘩中miR-21/mTOR信号通路相关分子的表达情况及五倍子瘢痕膏对该通路的干预作用，以阐明五倍子瘢痕膏抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的具体机制。

1 材料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 标本来源 瘢痕疙瘩组织标本来自徐州市中医院皮肤科36例行手术切除治疗的前胸部瘢痕疙瘩患者，其中，男17例，女19例，年龄12～65岁，平均（23.4±2.6）岁，病程3个月～4年，平均（13.7±0.6）个月。正常皮肤组织标本来源于徐州市中医院泌尿外科36例包皮过长患者所切除的包皮。

1.1.2 实验动物 6周龄裸鼠（BALB/C-nunu品系）36只，雌性，体质量18～22 g，购自徐州医科大学实验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 动物造模 参照Kischer法[6]，将36只裸鼠无菌环境进行适应性喂养1周后，称量体质量，计算水合氯醛麻醉量（麻醉量/裸鼠体质量=0.8 mL/10 g），采用腹腔注射麻醉裸鼠，颈背部皮肤切开，将人体手术切除的瘢痕疙瘩组织切割成5 mm×5 mm×5 mm方块，移植到裸鼠背部皮下，对称缝合，加压包扎，固定，37℃温箱麻醉复苏。14 d左右瘢痕疙瘩模型建成。

1.2.2 瘢痕疙瘩模型分组与干预方法 将瘢痕疙瘩模型随机分成2组，即治疗组和对照组，每组18只。治疗组涂抹五倍子瘢痕膏（处方组成为黑醋、五倍子、蜈蚣、丹参、威灵仙、地骨皮和白矾，由徐州市中医院制剂室制备成软膏），对照组仅涂抹基质（制作瘢痕膏的基质），3次/d，连续30 d。

1.2.3 RT-PCR检测正常皮肤组织和瘢痕疙瘩组织中miR-21 mRNA的表达 将手术取出的治疗组及对照组新鲜瘢痕疙瘩组织和正常皮肤组织制成组织匀浆，采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒（重庆威斯腾生物医药科技有限责任公司）进行总RNA提取，操作步骤按试剂盒说明书进行。电泳鉴定提取RNA的完整性，统一调整总RNA纯度为0.5 g/L，于－70℃储存。

采用实时荧光定量PCR仪（加拿大Funglyn Biotech公司）进行miR-21基因扩增。取5 μL RNA为反转录模板。反转录反应体系为20 μL，反应条件：25℃10 min，42℃60 min，85℃5 min。标准曲线定量法制备cDNA模板标准品，依次10倍梯度稀释，制备成5个梯度的cDNA模板定量标准品。内参基因选用U6，在GenBank数据库中获得目的基因mRNA序列，采用Primer Express 2.0软件，在CDS区设计特异性引物。引物序列见表1。

表1 miR-21基因引物序列及扩增产物片段长度

PCR反应体系为50 μL，反应条件：94℃预变性4 min，94℃变性20 s，60℃退火30 s，共循环30次，72℃延伸5 min。取5 μL PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶中，采用电泳仪（美国Bio-Rad公司）电泳，用GDS8000凝胶扫描系统（美国UVP公司）分析各条带的灰度值，以各目的基因与内参基因U6的灰度值比值表示mRNA的相对表达量（RQ）。基因的表达量RQ=2-ΔΔCt。RQ值越大表示基因表达量越高。

ΔΔCt计算方法：ΔΔCt=（待测样品的目的基因的Ct的平均值-待测样本的看家基因的Ct平均值）-（对照样品的目的基因的Ct平均值-对照样本的看家基因的Ct平均值）。

1.2.4 免疫组化检测正常皮肤组织和瘢痕疙瘩组织中磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、10号染色体张力缺蛋白磷酸酶（PTEN）、蛋白激酶B（Akt）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的表达

1.2.4.1 组织取材 采用颈椎脱臼法处死动物，随机取出移植裸鼠背部的瘢痕疙瘩组织，同时收集正常的包皮组织18块，采用高精度轮转式石蜡切片机（德国徕卡公司）切成5 mm×5 mm×5 mm小块，4%多聚甲醛低温保存72 h以上。

1.2.4.2 免疫组织化学染色 标本制作成4 μm厚的石蜡切片，入62℃烤箱30 min，二甲苯脱蜡2次，梯度酒精水化，磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗3次。封闭内源性过氧化酶，PBS漂洗3次。用正常山羊血清在37℃温箱中封闭非特异性抗原10 min，PBS漂洗3次。用一抗（鼠抗人mTOR、p-Akt1/2/3（B-5）、PTEN（A2B1）、PI3-Kinase p85（B-9）单克隆抗体，均为美国Santa Cruz公司产品）孵育切片入冰箱（4℃）过夜，用PBS漂洗3次。用生物素标记山羊抗裸鼠/兔IgG 37℃恒温孵育30 min，用PBS洗3次。滴入辣根酶标记链霉卵白素工作液10 min，切片采用DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）进行显色，室温下反应，待显色充分，及时用PBS漂洗2次。苏木素染色液孵育20 s，梯度酒精逐级脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.2.4.3 阴性对照 以PBS代替一抗孵育组织切片为阴性对照组。

1.2.4.4 染色结果判定 正置显微镜（德国徕卡公司）下观察，p-mTOR、Akt、PI3K以胞质着色为浅黄色、棕黄色、黄褐色为阳性细胞，PTEN以细胞核着色为浅黄色、棕黄色、黄褐色为阳性细胞，评分参考Shimizu法[7]，根据每张切片染色差异，按无着色、浅黄色、棕黄色、黄褐色分别记0、1、2、3分，以阳性着色面积/光镜下拍照面积占比0、小于1/3、1/3～2/3、大于2/3分别记0、1、2、3分。以2种评分之和≥3分记为阳性。

1.3 统计学分析 应用SPSS20.0软件对实验数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用配对t检验，计数资料采用卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-PCR检测mir-21 mRNA的表达 治疗组和正常皮肤组miR-21相对表达量差异无统计学意义（P＞0.05，t=1.24），但二者与对照组相比均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05，t=2.76、2.81）。见表2。

表2 mir-21 mRNA mRNA相对表达量 （±s）

表2 mir-21 mRNA mRNA相对表达量 （±s）

组别治疗组对照组正常皮肤组n 18 18 18 mir-21 6.03±2.52 10.26±2.69 5.51±2.36

2.2 免疫组化检测检测正常皮肤组织和瘢痕疙瘩组织中PI3K、PTEN、Akt、mTOR的表达 在本实验中观察到PI3K、Akt、mTOR主要表达在细胞质及少量细胞核中，PTEN主要表达在细胞核及少量细胞质中，均呈棕黄色。免疫组化染色检测结果显示，PI3K、Akt、mTOR在对照组中高表达，而在治疗组和正常皮肤组中低表达；PTEN在对照组中低表达，而在治疗组和正常皮肤组中高表达。见图1。

图1 3组PI3K、PTEN、Akt、mTOR的表达情况

PI3K、PTEN、Akt、mTOR在治疗组中表达阳性率分别为33.33%、88.89%、38.89%和16.67%，在对照组中表达阳性率分别为66.67%、22.22%、94.44%和72.22%，在正常皮肤组中表达阳性率为分别为27.78%、100.00%、44.44%和11.11%。3组之间阳性率比较差异有统计学意义（P＜0.05）。组间阳性率比较，治疗组与对照组之间差异有统计学意义（P＜0.05），对照组与正常皮肤组之间差异有统计学意义（P＜0.05），而治疗组与正常皮肤组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 3组PI3K、PTEN、Akt、mTOR免疫组化染色阳性例数 例

3 讨论

五倍子瘢痕膏是欧阳恒教授在瘢痕疙瘩“湿毒搏结，气血瘀滞”病机理论[8]指导下，以中医皮肤科奠基人赵炳南老先生创制的黑布药膏（由黑醋、五倍子、蜈蚣、蜂蜜、梅花冰片组成）为基础进行加减化裁而来，即五倍子瘢痕膏是在黑布药膏的基础上加丹参、威灵仙、地骨皮、白矾，同时去掉蜂蜜、冰片，应用现代工艺制成。五倍子瘢痕膏组方中老黑醋软坚解毒，五倍子收敛解毒，蜈蚣破瘀以毒攻毒，丹参活血祛瘀，威灵仙祛湿通络，地骨皮软化角质层、白矾解毒燥湿，全方合用有活血化瘀、软坚解毒的作用。本课题组在临床研究中外用五倍子瘢痕膏治疗瘢痕疙瘩，取得了很好的疗效，总有效率为96.56%[1]。此外，实验研究显示五倍子瘢痕膏能抑制瘢痕成纤维细胞增殖[2]，这将为应用化瘀软坚解毒法来防治瘢痕疙瘩提供科学依据。

miRNAs是一类对基因具有调控功能的内源性非编码小分子RNA。这类非编码的小RNA分子通过与靶基因3′非编码区（3′-UTR）完全或不完全匹配结合，诱导靶基因mRNA降解或影响其转录后翻译[9]，从而参与细胞的增殖、分化、凋亡和新陈代谢等一系列生物学过程。研究表明，miRNA有类似于抑癌基因或癌基因的功能，可以影响肿瘤的发生、发展。由于瘢痕疙瘩属于良性实体瘤，可向周围正常组织呈侵袭性生长，其病理特点与肿瘤极为相似，有类肿瘤特性，有学者借鉴miRNA在肿瘤中的研究成果，将其应用于瘢痕疙瘩的研究之中[10]。有研究者应用基因芯片技术证明了miRNA在病理性瘢痕与正常皮肤组织中存在着差异性表达[3-4]，其中miR-21在增生性瘢痕组织中表达显著高于正常皮肤组织[5]。这提示miR-21与瘢痕疙瘩的发生有密切的关系。2006年，Fanyin等[11]确证了miR-21的一个靶基因是PTEN，而PTEN是有磷酸酶活性的抑癌基因[12]，也是mTOR信号通路的一个重要负反馈调控因子。

mTOR信号通路是调控蛋白质合成的主要信号通路，参与细胞增殖、分化等调节，日益受到有关研究者的重视，逐渐成为研究的热点。mTOR信号通路包括上游的PI3K、Akt、PTEN，其中PTEN是负反馈调节因子；下游的核糖体蛋白S6K、真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白（4EBP），二者均是蛋白翻译的关键调节因子。胞外信号与跨膜的酪氨酸激酶受体结合后，受体酪氨酸残基被磷酸化而激活，从而与PI3K的调节亚基p85结合，再激活PI3K，活化的PI3K可激活下游的Akt，活化的Akt激活mTOR。mTOR是蛋白合成的关键调节物，激活后的mTOR作用于下游的2个主要靶蛋白，即S6K和4EBP。近年来研究证实，mTOR基因与细胞异常增殖及肿瘤的发生密切相关，在多种肿瘤，如胶质瘤、食管癌、大肠癌等组织中表达明显增强[13]。如前所述，瘢痕疙瘩有类肿瘤特性，因此在瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖过程中mTOR信号通路应当有重要的作用。这一推断可得到其他一些研究结果的证据支持，如董海良等[14]发现槲皮素可通过活化mTOR信号通路，启动蛋白质翻译起始复合物的形成，进而促进小鼠皮肤成纤维细胞的增殖。吴登艳等[15]发现黄芩苷可通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制人增生性瘢痕组织成纤维细胞的增殖。此外，还有袁德品等[16]证实mTOR和p70S6K在瘢痕疙瘩组中的表达明显高于非瘢痕疙瘩组和正常皮肤组织，且mTOR和p70S6K表达呈正相关，说明瘢痕疙瘩中存在异常活化的mTOR/P70S6K信号通路，这与mTOR/p70S6K信号通路在成纤维细胞增殖中的相关研究相符。

本研究应用RT-PCR、免疫组化技术来探讨miR-21及mTOR信号通路关键分子在瘢痕疙瘩中的表达情况及五倍子瘢痕膏对其的调控作用。RTPCR检测结果显示，治疗组和正常皮肤组miR-21相对表达量差异有统计学意义（P＞0.05，t=1.24），但二者与对照组相比均明显降低，差异有统计学意义（P<0.05，t=2.76、2.81）。这说明miR-21在正常皮肤组织中低表达，而在瘢痕疙瘩中高表达，经五倍子瘢痕膏干预后其表达量明显降低。免疫组化检测结果显示，PI3K、Akt、mTOR在对照组中高表达，而在治疗组和正常皮肤组中低表达；PTEN在对照组中低表达，而在治疗组和正常皮肤组织中高表达。以上研究结果表明，miR-21/mTOR通路参与了瘢痕疙瘩的形成过程，而五倍子瘢痕膏对该信号通路存在干预作用。五倍子瘢痕膏抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的机制可能与其通过抑制miR-21表达而上调PTEN表达，进而下调mTOR信号通路中PI3K、Akt、mTOR表达有关，这为五倍子瘢痕膏治疗瘢痕疙瘩提供了理论依据。