在耐热的马克斯克鲁维酵母中构建微生物细胞工厂

王冬梅, 洪 泂

(中国科学技术大学 生命科学学院，合肥230026)

由于微生物具有多样的代谢能力，可方便地进行基因工程改造，通常还有快速增殖能力、易大规模培养等优点，被广泛地用于构建微生物细胞工厂，生产大宗化学品、精细化学品、生物燃料、药物及各种天然产物等。目前最常用的是以酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)为基础构建的真核微生物细胞工厂。由于酿酒酵母有悠久的研究历史，其遗传操作技术成熟，基因组信息也比较明确，而且还积累了大量的基因功能与生化方面的信息，使其可以生产多种多样的产品[1]。而许多非酿酒酵母的酵母菌由于其特殊的遗传及代谢特点，在微生物细胞工厂的应用中也很有特色。例如巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)可以利用甲醇等甲基底物，解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)能利用含脂肪或蛋白质的废料，这使它们在一些领域比酿酒酵母更有优势。马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)由于具有耐热、高生长速率和很强的五碳糖与菊糖利用能力，在构建微生物细胞工厂方面具有独特的优势。

1 马克斯克鲁维酵母的基本特点

马克斯克鲁维酵母属于真菌-子囊菌门-酵母菌亚门-酵母菌目-酵母科-克鲁维酵母菌属。它于1888年第一次被发现，广泛存在于昆虫和果实中，并且在发酵乳制品例如奶酪和克菲尔粒中大量存在，通过生产各种脂类、酮类、醛类和醇类物质使奶制品有特殊的风味，也正因为如此马克斯克鲁维酵母是经美国FDA认证的一种GRAS (Generally Recognized as Safe)级别的微生物，2013年中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会批准此酵母为可食用菌种。马克斯克鲁维酵母本身还具有很多其他的优势使其可能成为工业生产菌株：首先，可以在高温下进行生长和发酵，有些菌株最高生长温度达52 ℃[2]。这就意味着在工业级发酵中可以降低冷却费用以及产物的蒸馏分离成本[3]，可以在夏季及热带地区方便地进行发酵生产；同时被杂菌污染的可能性也大幅降低；还可以提高发酵过程中添加酶的催化效率，例如纤维素酶、淀粉酶等，这都可以降低生产成本[4]。其次，它可以利用非常广泛的碳源，利用葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、乳糖和菊糖等作为单一碳源进行生长。这些碳源中许多是农林业或乳制品业的废物或副产物中的主要成分，例如木糖是木质纤维素中半纤维素的主要成分，乳清是乳制品工业中产生的富含乳糖的副产物，菊糖在菊芋、菊苣中大量存在，这使得马克斯克鲁维酵母利用廉价原材料等进行发酵成为可能。最后，马克斯克鲁维酵母具有很高的生长速率，在40 ℃时生长速率可达0.86～0.99/h，被认为是生长最快的真核生物[5]，可以迅速获得大量的细胞，提高生产速率。

综上所述，马克斯克鲁维酵母作为一种生物安全的真核微生物，能够利用多样的碳源、高生长速率、耐高温等特点，使得它成为潜在的工业生产应用菌，被越来越多的研究人员用于构建微生物细胞工厂。

2 野生型马克斯克鲁维酵母在微生物细胞工厂上的应用

鉴于马克斯克鲁维酵母有很多优秀的品质，有很多天然的菌株直接作为微生物细胞工厂生产各种产品。

2.1 菊糖酶的生产

菊糖酶(inulinase)，也叫菊粉酶，水解2,1-β-D-果聚糖果糖苷键，产生果糖、葡萄糖或寡聚果糖，可以用于生产高果糖浆、寡聚果糖，而产生的果糖和葡萄糖还可进一步用于发酵生产乙醇等其他产品。很多马克斯克鲁维酵母是天然的菊糖酶高产菌株(表1)。其中K.marxianusYS-1菌株经过多轮条件优化后，所产菊糖酶酶活从最初的47.3 U/mL提高到了140.23 U/mL[6]，而K.marxianusNBRC1777在木糖的诱导下，酶产量可达330 U/mL[7]。通过优化培养基和培养条件，K.marxianusNRRL Y-7571可表达1294 U/mL菊糖酶[8]。不过可能由于酶的热稳定性，以及最适产酶条件等问题，大多没有采用高温条件下培养产酶。

表1 天然能够高效生产菊糖酶的马克斯克鲁维酵母菌株

注：CDW为细胞干重；ds为干底物

2.2 利用生物质和农牧业废料进行发酵生产乙醇

由于生物质燃料乙醇来自生物质，而生物质的可再生、可持续特性使生物质乙醇在减少化石燃料使用、降低温室气体排放等方面很有优势，对农牧业废料的利用还可以减少环境污染、提高企业效益。由于马克斯克鲁维酵母不仅耐热，在高温(>40 ℃)下依然有不错的乙醇发酵能力，因此也被广泛地用于利用生物质和农牧业废料生产乙醇的研究中。

首先是利用菊芋、龙舌兰等高菊糖含量的生物质材料生产乙醇。由于很多马克斯克鲁维酵母能够天然表达和分泌大量的菊糖酶，这赋予了该酵母高效利用菊芋等高菊糖含量材料的能力。在利用这些生物质时，无需补充菊糖酶，马克斯克鲁维酵母就可以直接水解菊糖，也就是通过联合生物加工(consolidated bioprocessing，CBP)高效生产乙醇(表 2)。其中利用菊芋生产乙醇的能力最高可超过90 g/L[13]。不过为了保证发酵过程中菊糖酶的表达，发酵温度并不高。

其次，利用乳清或乳清渗出液等乳业废料生产乙醇。马克斯克鲁维酵母广泛存在于乳制品中，有很好的利用乳糖的能力，而乳制品废料中含有很高的乳糖(乳清4%～5%，乳清渗出液 6.8%～8.5%)[14]，因此可利用马克斯克鲁维酵母转化乳糖。通过连续培养发酵装置，Jedrzejewska 等利用乳清生产乙醇，生产速度最高可达8.61 g/L·d，得率0.203 g/g[15]。而从奶酪中分离出的K.marxianusURM 7404菌株以乳清和乳清渗出物为材料生产乙醇，产量达11.48 g/L，生产速率达0.75 g/L·h[14]。

最后，利用木质纤维素生物质生产乙醇。由于马克斯克鲁维酵母天然能利用葡萄糖和木糖，而木质纤维素生物质水解后最主要的可发酵单糖是葡萄糖和木糖，因此马克斯克鲁维酵母也被用于蔗渣、葵粕、腰果渣、麦秆、柳条稷、双稃草等木质纤维素生物质类型农林废料水解液的发酵(表2)。由于马克斯克鲁维酵母不表达纤维素酶，所以在利用木质纤维素生物质时需要添加纤维素酶，通常先通过纤维素酶将木质纤维素糖化再利用(SHF)，或者进行同步糖化与发酵(SSF)。由于这种酵母可以在较高温度下生长和发酵，而商业化的纤维素酶的最适温度在48～50 ℃，这使得它在利用木质纤维素生物质方面更有优势。

正是由于马克斯克鲁维酵母可以在高温发酵，因此采用该酵母通过SSF生产纤维素乙醇的研究较多，以下列举一些高效率地木质纤维素生物质的同步糖化与发酵的例子，可以看出在利用木质纤维素生物质的同步糖化与发酵过程中，采用的发酵温度都较高，多在40 ℃以上，甚至达到了45 ℃(表 2)。早在1991年，Ballesteros等就成功地采用马克斯克鲁维酵母在42 ℃通过SSF利用纤维素生产乙醇，产量达37.6 g/L。其后，出现大量通过同步糖化与发酵利用木质纤维素生物质的研究，但是产量都不高。de Barros研究组和Saini研究组，采用马克斯克鲁维酵母分别对腰果渣和麦秆在40 ℃和42 ℃进行了同步糖化与发酵，乙醇产量都超过了60 g/L(表2)。通过SSF利用木质纤维素生物质生产乙醇的产量仍然不是太高的几个因素为：1)马克斯克鲁维酵母的乙醇耐受性不够好；2)前处理后的木质纤维素生物质中有发酵的抑制物；3)木质纤维素生物质中只有部分单糖能够水解释放出来，导致酵母实际能利用的糖浓度并不高；4)葡萄糖抑制效应的存在导致对木糖等五碳糖的利用效率太低。

表 2 利用野生型马克斯克鲁维酵母生产乙醇

注：“-”没有数据

2.3 苯乙醇的生产

野生型的马克斯克鲁维酵母还具有较好风味和芳香化合物的生产能力[28]。它们常常在酸奶、奶酪和葡萄酒中存在，对这些产品的风味有重要贡献，但是对这方面生产研究的报道并不多。

苯乙醇(2-phenylethanol)由于有玫瑰的香味和甜味被广泛地在化妆品和食品工业中作为香料和调味剂，天然的苯乙醇从玫瑰花瓣中提取，效率较低；大规模的商业化产品由化学法合成，但是化学法合成中溶剂和副产品会影响苯乙醇品质；近年来，消费者更喜欢生物法的天然产物，这就有了发酵法生产苯乙醇的需求。由于苯乙醇对酵母细胞有一定的毒性，所以通常马克斯克鲁维酵母生产苯乙醇的产量不高, 生产速度也比较低。De Lima 等筛选到的K.marxianusCCT 7735能够生产3.44 g/L的苯乙醇[29]，已经是很高的产量了，但是离工业化生产要求的产量仍有很大差距。通过原位产物移除技术(insituproduct removal, ISPR)，可以不断地将培养基中的苯乙醇吸附或分离到另一相中，从而降低培养基中苯乙醇的浓度，提高苯乙醇的产量和生产速度。其中通过采用Hytrel 8206 珠子的液固双相分离系统的方法，K.marxianusCBS 600在35 ℃利用苯丙氨酸生产苯乙醇的浓度达到了20.4 g/L，其生产速率高达0.43 g/L·h[30]。

2.4 乙酸乙酯(ethyl acetate)的生产

乙酸乙酯是一种可以降解的对环境友好的溶剂，世界产量超过17 000 000 t，目前的乙酸乙酯以化石燃料为材料通过化学法合成，而通过微生物利用可再生原材料进行合成是一个不错的替代方法。有一系列采用马克斯克鲁维酵母利用废乳清为材料生产乙酸乙酯的报道，中试规模的生长显示得率可达0.265 g/g, 生产速率可达 2 g/L·h[31]，但产量都不太高，仍需进一步改进提高。

3 基因工程改造的马克斯克鲁维酵母在微生物细胞工厂上的应用

虽然马克斯克鲁维酵母具有很多优秀品质，但是在抗逆方面与在工业上广泛利用的酿酒酵母相比还有一定差距。另外，虽然马克斯克鲁维酵母能够利用很多酿酒酵母不能利用的木糖等五碳糖，但是葡萄糖抑制效应同时存在，影响混合糖的利用效率。最后，提高马克斯克鲁维酵母对产品的生产效率，以及通过合成生物学方法使该酵母能够生产原本不能合成的产品，也需要对马克斯克鲁维酵母进行基因工程改造，设计和搭建新的代谢路径。

3.1 基因操作方法

对微生物进行基因工程操作，需要具有选择标签的宿主、和选择标签配套的质粒系统、能够表达异源蛋白的启动子和终止子、外源基因DNA(质粒)的转化方法及基因敲除方法等一系列条件和技术。

3.1.1 宿主

对微生物进行基因工程改造必须有合适的选择标签，以便对基因敲除或过表达等修饰改造后的菌株进行筛选。真核生物中常用的选择标签包括抗生素的抗性标签和营养缺陷型标签。

在马克斯克鲁维酵母中已证明可使用的抗生素的抗性标签有G418[1，32]，博来霉素(bleomycin)等抗性标签[3]。由于这类抗性标签不需要对宿主细胞进行改造，可以直接使用，有很大的便利性，但是如果采用的是游离质粒系统，在无抗生素培养基中容易丢失，而且在食品和医药相关的产品生产中要尽量避免在培养基中添加抗生素，因此，营养缺陷型的使用会更为广泛。

马克斯克鲁维酵母中已经使用的营养缺陷型标签和酿酒酵母类似，主要是TRP1、LEU2、URA3等标签[32]。要使用营养缺陷型标签筛选，培养基中就不能含有对应的营养物质，例如对应TRP1、LEU2、URA3营养缺陷型，培养基中不能含有色氨酸、亮氨酸和尿嘧啶才能够对转化子进行筛选。目前已报道的菌株，以URA3的标签为主，这是因为只有URA3敲除或无功能突变体才能在含有5-氟乳清酸的培养基上生长[32-33]。此外，对于一个菌株，同时能用的选择标签越多，就意味着能够导入的外源基因就越多，这对在构建微生物细胞工厂时设计和重构代谢路径过程中要进行的多个基因敲除和表达尤为方便。

3.1.2 质粒系统

和酿酒酵母类似，马克斯克鲁维酵母中的质粒也分游离质粒和整合型质粒两大类，而且为了方便质粒的构建和扩增，一般都是大肠杆菌和马克斯克鲁维酵母的穿梭载体。

整合型质粒比较简单，只需要有一个马克斯克鲁维酵母中可用的选择标签即可，一般可以以大肠杆菌的质粒为基础，含有大肠杆菌中自主复制的元件例如常见的ori，大肠杆菌筛选的标记例如氨苄青霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、博来霉素抗性基因等。在此基础上插入与酵母宿主遗传缺陷型对应的基因例如URA3、LEU2、TRP1等[32]，或者抗性基因例如卡那霉素抗性(对应G418)[1，32]、博来霉素抗性基因[3]，然后再加上需要转入酵母的DNA片段，例如外源基因的表达框等。总的来说，和酿酒酵母的整合型质粒没有太大区别。由于很多酿酒酵母的启动子等元件能够直接在马克斯克鲁维酵母中执行功能，所以很多酿酒酵母中的质粒可以作为整合型质粒在马克斯克鲁维酵母中使用。

游离型质粒是可以在马克斯克鲁维酵母细胞中的染色体外独立存在并自主复制的质粒。这类质粒中最重要的元件是使该质粒可以独立存在和复制的序列。主要有3大类：第一类是衍生于来自Kluyveromycesdrosophilarum的KD1质粒，早期的研究发现KD1质粒也可以在马克斯克鲁维酵母中独立存在和复制，因而以pKD1为基础，构建了一类马克斯克鲁维酵母的游离质粒，例如pKDU7[34]，细胞内拷贝数可达40。第二类是来源于粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)的pDblet[35]，也能在马克斯克鲁维酵母中独立存在和复制，但是拷贝数低。第三类游离型质粒主要是包含来自染色体自主复制序列(autonomously replicating sequence，ARS)和着丝粒序列。其中最小的ARS仅60 bp即可使得质粒能够以游离质粒存在[36]。在马克斯克鲁维酵母中包含ARS和中心粒的质粒，拷贝数比较低(2～4拷贝)[36-38]。

3.1.3 启动子和终止子

要想在酵母中表达外源基因，构建表达框时必须有启动子和终止子。

启动子又分为组成型启动子和诱导型启动子两大类。常用的组成型启动子包括PPGK、PTDH3、PADH2、PTEF1等启动子[39-40]，虽然表达基因的能力有强弱区别，但主要是一些维持细胞正常代谢所需基因的启动子，受培养条件的影响较小，或者虽然受培养条件影响，但不会引起非常剧烈的表达水平的改变。随着越来越多的科研人员对马克斯克鲁维酵母的重视，对马克斯克鲁维酵母中启动子的强度进行了评测。我们以β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酸酶基因的表达为指标，对系列组成型启动子进行了测试，证实测试的启动子强度顺序为PKmPGK>PKmTDH3>PScPGK>PScTDH3>PKmADH1>PScADH1[39]，而Lee研究组则采用绿色荧光蛋白的表达测试了来自酿酒酵母的组成型启动子在马克斯克鲁维酵母中的表现，结果显示PGPD>PADH≈PTEF>>PCYC[33]。Rajkumar等对启动子进行了进一步的系统研究，确定PKmTDH3、PScTDH3、PENO1、PFBA1和PPGK1启动子为强启动子，PTDH1和PHHF1为中等强度启动子，PREV1和PGDH2为弱启动子[1]。

另一类启动子为诱导型启动子。目前在马克斯克鲁维酵母中主要是糖诱导的启动子。由于此酵母具有较强的乳糖利用能力，其自身的β-半乳糖苷酶LAC4基因的启动子和酿酒酵母GAL1基因的启动子可以在该酵母中通过诱导调控，在以乳糖或半乳糖为碳源时，控制的基因表达水平可以上调6～15倍[1]。另外，由于马克斯克鲁维酵母天然地高效利用木糖，利用木糖的关键基因木糖还原酶、木糖醇脱氢酶等基因的启动子，也是潜在的可诱导启动子[41]。很多马克斯克鲁维酵母菌株能天然地生产大量的菊糖酶，菊糖酶的启动子PINU1很早就被确定是个强的诱导型启动子，早在1993年，为了验证菊糖酶启动子的效率，将一个来源于瓜尔豆的α-半乳糖苷酶在菊糖酶的启动子控制下高效表达，产量达153 mg/L[42]。由于菊糖启动子表达外源基因的重复性不好，虽然有一些测试性地表达外源基因的报道，但一直没有广泛应用，直至最近，吕红研究组对其进行了系统研究，并以此为基础构建了外源蛋白基因高表达的质粒系统[43-44]。由于马克斯克鲁维酵母是耐热酵母，所以有些基因的表达受温度影响比较大，例如HAP60、HAP104、TSA1以及SSA2等基因启动子随温度上升表达水平也上升[1]。另一个负调控的启动子Tet-off通过控制β-葡萄糖醛酸酶的表达进行了测试，可以通过添加四环素关闭所控制的基因的表达[45]。

在酵母中表达外源基因时对终止子的关注较少，但是终止子也会影响基因的表达。我们在研究马克斯克鲁维酵母中启动子强度时，为了避免终止子影响表达，统一采用了TDH3基因的终止子(TTDH3)[39]，其他常用的终止子包括菊糖酶基因的终止子(TINUI)[44,46]、LAC4、PGK、ADH、TEF等基因的终止子[1，3，47-49]。在相同的启动子控制下，使用不同的终止子的表达强度会不同，趋势为TPGK>TPDC>TADH1>TINU1>TLAC4[1]，但是启动子的作用更大一些，即使表达量低一些的终止子和强启动子组合，外源蛋白的表达也会大幅度上升。

3.1.4 基因敲除和Crispr-cas9

在马克斯克鲁维酵母中进行基因敲除有两种策略。第一个策略是采用同源臂构建敲除框，在酵母细胞中通过同源重组，与染色体上的对应基因进行替换，将基因组中的对应基因置换成破坏或部分删除的基因(敲除框)，达到基因敲除的目的[32,40]。这个方法和酿酒酵母中的方法类似，但是由于马克斯克鲁维酵母中外源基因DNA插入染色体DNA时以非同源重组为主，导致依赖同源臂重组的基因敲除效率要低很多，而且同源臂要求比较长，一般500 bp以上。在敲除中用于构建敲除框和基因敲除菌株的选择标签一般用卡那霉素抗性或URA3居多[32]。采用卡那霉素抗性基因结合培养基中添加G418进行筛选，可以直接对野生型菌株进行敲除，比较方便；而采用URA3作为筛选标签，需要事先构建URA3的敲除菌株或者失活突变菌株(营养缺陷型)。但是由于URA3营养缺陷型很容易在添加5-氟乳清酸的培养基中进行筛选，实际上使用时并不麻烦，并且正因为有5-氟乳清酸的负筛选存在，很方便循环使用URA3标签。

在多个基因敲除时，需要对筛选标签进行循环删除，也就是敲除第一个基因后，将选择标签进行删除，可以再次利用URA3构建下一个基因的敲除框。除了直接对转入的标签进行再敲除外，还有两个常用的便利策略，即hisG系统[32]和Cre-loxP系统[50]。本文作者采用hisG系统对K.marxianusNBRC 1777进行了多重敲除，获得了TRP1、LEU2、URA3三重营养缺陷型的菌株[32]，而Ribeiro等通过Cre-loxP系统对马克斯克鲁维酵母中的两份β-半乳糖酶基因LAC4成功进行了敲除[50]。

hisG系统仅包括两端相同的来自沙门氏菌的hisG序列，在构建敲除框时，该序列链接在选择标签例如URA3基因序列的两端，同源臂序列的内侧即可。此系统的优点是两个hisG序列能够自发的重组，删除其中的选择标签基因，不需要额外标签去除步骤，所以只需将敲除菌株稀释涂布到平板培养基培养，挑选少量菌株鉴定是否丢失了选择标签即可，操作简单方便；缺点是hisG长达1 kb，构建敲除框比较麻烦，而且由于自发重组的频率高，导致质粒不稳定，有时构建敲除框难度大。

Cre-LoxP系统由一个识别LoxP位点的重组酶Cre和34 bp的保守的loxP位点组成[50]。Cre-loxP系统的优势是LoxP序列很短，在构建敲除框时可以通过PCR直接引入，简单快捷，缺点是通常需要另一份表达Cre的质粒，会占用一个选择标签，有时还需要通过无选择压力的培养，去除Cre质粒。

随着Crispr-cas9技术的发展，该技术也被用于马克斯克鲁维酵母系统之中[40，51-55]。这个系统有通过ARS/CEN[51-53]、pKD1[55]或pDblet[40]为基础构建的游离质粒系统，也有将Cas9整合到基因组中的[54]。而控制gRNA转录的启动子和酿酒酵母类似，主要是SNR52启动子[51-52,54]、苯丙氨酸或甘氨酸tRNA启动子[51,53]。Lobs等测试了各种RNA聚合酶III的启动子转录gRNA后的敲除效率，以木糖醇脱氢酶基因(XYL2)敲除为例，发现RPR1-tRNAGly 杂合启动子效率最高，敲除效率达66%；甘氨酸的tRNA启动子控制的gRNA，敲除效率也不错，可达52%；而常用的SNR52启动子控制下敲除效率仅有10%[51]。在采用游离质粒的Crispr-Cas9系统中，Cas9的表达和gRNA的转录元件通常会放在同一个质粒中转化酵母细胞。这样可以减少转化过程，提高效率，也方便敲除后Cas9基因的去除和更换gRNA，这对减少脱靶以及多重敲除有很大帮助。

3.2 重组表达生产外源蛋白的微生物细胞工厂

这部分外源蛋白的生产是指以获得大量重组蛋白为目的的研究。在马克斯克鲁维酵母的遗传操作系统的构建过程中，尤其是启动子和表达条件等研究中，表达的一些β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酸酶、荧光蛋白等基因，目的是验证表达系统效率，不是获得外源蛋白；而代谢工程改造方面也需要表达外源基因，但是目的不是外源蛋白，而是其他目标产品，因此不归在此类。

由于马克斯克鲁维酵母的表达系统研究较少，所以与巴斯德毕赤酵母等其他菌株相比较，以获取外源蛋白为目的的研究报道也比较少。虽然有大量的启动子可以使用，但是以外源蛋白的高表达为目标时，一般采用诱导型启动子将菌体生长和蛋白表达适当地分离，有利于获得更高浓度的产品。

马克斯克鲁维酵母中将乳清克鲁维酵母来源的超氧歧化酶在乳清酵母的ADH4启动子控制下进行了表达，产量达 24.1 kU/L[56]，通过菊糖酶启动子对嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)的酯酶进行表达的产量达56.9 U/g 细胞干重[49]。而通过敲除MIG1基因解除葡萄糖抑制效应可以使β-半乳糖苷酶产量提高到121.0 U/mL[57]。对菊糖酶启动子和分泌的信号肽进行的研究中，成功地对几种纤维素水解相关的酶进行了高效表达(表3)，该系统还成功地表达了猪圆环病毒颗粒，产量达到了1.91 g/L的水平[43]。虽然有很多马克斯克鲁维酵母天然地高效表达菊糖酶，但是在工业生产中，酶制剂的成本越低越好，也就要求更高的产量，因此重组表达是一个重要的策略。 Zhou等在K.marxianusKM-526菌株中成功实现了菊糖酶重组表达，产量达133.5 U/mL[58]。之后，Zhang等构建了K.marxianusKM-KN16菌株，通过优化启动子、优化菊糖酶基因密码子和采用高密度培养，菊糖酶产量高达896.1 U/mL[59](表3)。总的来看，马克斯克鲁维酵母以外源蛋白表达为目的的研究不多，但是，由于马克斯克鲁维酵母具有快速增殖能力和高密度培养能力(OD600最高可超过700)，在大量表达外源蛋白上应该很有前景。

表 3 马克斯克鲁维酵母中重组蛋白的表达

3.3 通过基因工程改造构建的微生物细胞工厂

通过基因工程手段和合成生物学理念为基础的改造，可以提高马克斯克鲁维酵母生产能力，还能够使马克斯克鲁维酵母获得新的产品生产能力，因此有了不少通过基因工程改造构建的微生物细胞工厂的报道。

3.3.1 生产乙醇

虽然野生型马克斯克鲁维酵母也用于乙醇的发酵生产，但是为了进一步提高马克斯克鲁维酵母的乙醇生产能力，对各种底物的利用能力以及抗逆特性进行了基因工程改造。

Yuan等通过在马克斯克鲁维酵母中表达菊糖酶基因，将利用菊糖生产乙醇的产量和速率，分别从93.7 g/L 和 1.12 g/L·h提高到96.2 g/L和 1.34 g/L·h, 利用菊芋生产乙醇的产量和速率从62 g/L 和 1.29 g/L·h提高到 69 g/L 和 1.44 g/L·h[60]。我们通过在马克斯克鲁维酵母中表达淀粉酶，实现了在42 ℃不添加淀粉酶的情况下利用生淀粉生产乙醇，产量达79.75 g/L[61]。

木糖是木质纤维素生物质水解液中主要的可发酵单糖之一，虽然马克斯克鲁维酵母能利用木糖，但是由于其木糖代谢路径中木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的辅酶偏好性不同，导致氧气受限制时马克斯克鲁维酵母利用木糖的能力不足。为了提高马克斯克鲁维酵母利用木糖发酵的能力，既可以将其中的氧化还原路径替换成木糖异构酶路径，避免对辅酶的依赖，也可以将木糖还原酶和木糖醇脱氢酶换成辅酶兼容的组合，避免氧气受限制的发酵条件下辅酶的不平衡问题。我们在K.marxianusYRL005中成功表达了木糖异构酶基因，该菌株在42 ℃消耗20 g/L的木糖，产生8.25 g/L乙醇，没有木糖醇积累[62]。不过在酵母中高效表达木糖异构酶一直是一个难题，因此这方面成功的例子较少，而且表达效率距离工业生产要求还很远。改造木糖的氧化还原路径的研究比较多一些。我们通过将K.marxianusYHJ010的木糖还原酶基因替换成各种突变体，使乙醇产量提高了12.24倍，而Goshima等通过重组表达树干毕赤酵母的木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和酿酒酵母的木酮糖激酶使得获得的菌株能够在42 ℃利用木糖生产4.9 g/L的乙醇[63]。随后的进一步研究中，我们将木糖还原酶替换成脉孢霉的木糖还原酶，同时与木糖醇脱氢酶的突变体进行各种组合的筛选，对下游磷酸戊糖途径进行强化，获得的YZJ088菌株在42 ℃利用118.39 g/L木糖，生产 44.95 g/L乙醇，生产速率达2.49 g/L·h，该菌株还能够利用葡萄糖和木糖共发酵生产51.43 g/L乙醇[64]，被认为是利用五碳糖发酵最好的马克斯克鲁维酵母，生产速率已经和已知的最好的酿酒酵母工程菌株相匹敌[65]。Suzuki等把马克斯克鲁维酵母中的XDH替换成偏好于使用辅酶NADP+，在40 ℃利用木糖生产乙醇的得率提高到了0.402 g/g[66]。

而利用木质纤维素生物质生产乙醇除了前文提到过的同步糖化和(共)发酵(SSF)外，还有一个联合生物加工(CBP)策略，该策略的终极目标是把纤维素酶的生产和利用糖的发酵整合在同一菌株中，避免添加纤维素酶，大幅度降低成本。 联合生物加工策略被认为是更有前景的方法，但是由于纤维素酶表达的困难，这个策略挑战也更大。我们在K.marxianusYHJ029中表达了耐热的β-葡萄糖苷酶、内切-1，4-葡聚糖苷酶和纤维二糖水解酶，实现了在45 ℃不添加纤维素酶的前提下利用纤维二糖产43.3 g/L 乙醇，或者利用羧甲基纤维素为碳源生长[32]。而另一个研究报道了表面展示内切葡萄糖苷酶和β-葡聚糖苷酶的KΔU/AGEGII-AGBGL菌株实现了无外加纤维素酶条件下，在48 ℃利用β-葡聚糖生产乙醇[67]。而表达了8种不同纤维素酶的KR9菌株有了不错的纤维素酶活性，可以大幅度降低额外补充的纤维素酶量，距离成功又前进了一步[48]。

3.3.2 生产乳酸

乳酸在医药、农业及食品上有很大的需求，而可降解塑料更是要求高光学纯度(optical purity)的乳酸。生物合成乳酸可以容易获得高光学纯度的乳酸，而且在医药、食品等领域相对化学法合成的乳酸有更好的生物安全性。Bae 等通过敲除马克斯克鲁维酵母中的丙酮酸脱羧酶(PDC1)基因和过表达L或D-乳酸脱氢酶基因获得了直接利用菊芋生产乳酸的菌株，生产L-乳酸和D-乳酸的产量达130 g/L和122 g/L, 光学纯度超过99%。但是这样的结果是在很大的接种量下实现的(OD600=25)，不适合工业化生产，而且发酵温度较低(35 ℃)[68]。而我们在同时利用葡萄糖和木糖生产丙酮酸的基础上[69]，通过筛选和表达高效的L-乳酸脱氢酶，同样实现了直接利用菊芋生产L-乳酸，在低接种量(OD600=1.0)，42 ℃条件下，产量达125.93 g/L。 同时还实现了同步糖化和共发酵(SSCF)利用碱处理的玉米芯生产L-乳酸，产量达103.00 g/L，光学纯度99.5%，是第一个报道的利用木质纤维素类生物质生产乳酸的酵母菌株[40]。

3.3.3 生产果糖糖浆

尽管马克斯克鲁维酵母能够大量表达菊糖酶，但是由于马克斯克鲁维酵母本身有强大的葡萄糖和果糖利用能力，生长过程中会消耗大量的葡萄糖和果糖，因此在利用菊芋等材料制备高果糖浆的时候，采用的是菊糖酶的酶制剂。如果消除马克斯克鲁维酵母利用果糖的能力，即可获得直接降解菊糖和利用葡萄糖的菌株，用于生产含葡萄糖极低的果糖糖浆。我们通过敲除K.marxianusYHJ010的己糖激酶(HXK1)基因，过表达葡萄糖激酶(GLK)基因，消除了该菌株利用果糖的能力，使得该菌株可以在42 ℃，利用未灭菌菊芋，在不添加额外营养的条件下高效生产果糖糖浆，最高产量和最大生产速率分别为 234.44 g/L 和 10.26 g/L·h[70]。这个策略避免了制备酶制剂的步骤，使成本进一步降低。

3.3.4 生产木糖醇

虽然有不少将木糖通过发酵生产乙醇的研究，但是生物质乙醇的主要目标燃料乙醇的成本压力很大，而木糖醇作为一种重要的甜味剂，在药品、保健品、食品和饮料工业中广泛使用。此外，木糖醇的价格比乙醇要高得多，生产木糖醇也使企业更容易生存和发展。预计2020年全球木糖醇需求达250 000 t[71]，目前的生产木糖醇的化学转化方法需要高温高压和金属催化剂，而且需要高纯木糖，成本相对较高，污染相对较大，因此通过生物法将木糖转化成木糖醇的研究也一直在进行中。虽然有些假丝酵母有较好的木糖醇生产能力，但是致病性导致这些酵母的应用受到一定的影响，而生物安全的马克斯克鲁维酵母在这方面很有优势。在马克斯克鲁维酵母中构建生产木糖醇的酵母有两个途径，既可以通过过表达木糖还原酶，促使木糖醇积累，也可以敲除木糖醇脱氢酶基因，避免木糖醇代谢，使木糖醇积累。为了进一步提高效率，还可以将两者结合起来。我们构建的过表达脉孢霉的木糖还原酶的菌株YZJ015，在42 ℃生产木糖醇产量达132.31 g/L，循环使用酵母细胞发酵时，生产速率达4.41 g/L·h；而以木糖醇脱氢酶基因敲除菌株为平台构建的菌株，以甘油为辅助底物，生产木糖醇的得率接近100%[72]。在此基础上通过过表达木糖转运蛋白，使生产速率进一步提高，分批发酵的生产速度达到4.14 g/L·h, 通过补料，木糖醇产量达到了312.05 g/L[73], 为报道的最高产量，而且添加的木糖无需灭菌。其后，我们在敲除己糖激酶基因和过表达葡萄糖激酶的基础上通过过表达木糖还原酶和木糖转运蛋白，成功地避免了葡萄糖对木糖代谢的抑制，构建的菌株YHY013利用玉米芯水解液和木糖母液，木糖醇产量分别为118.63 g/L 和101.75 g/L[41]。还有一些其他的马克斯克鲁维酵母生产木糖醇的研究，但产量较低，基本是代谢机制方面的探索[74-77]。

3.3.5 其他产品

由于马克斯克鲁维酵母有很高的生长速度，还可以进行高密度培养，因此对一些和菌体相关的产品的生长有特别的优势。虾青素是一种脂溶性色素，有很强的抗氧化能力，由于其脂溶性，虾青素一般不分泌到培养基中，而是在细胞的膜系统上，因此高浓度的菌体可以提高产量。在K.marxianusS3-2 菌株中引入虾青素的合成路径之后，通过调整基因拷贝数和选用合适的酶的突变体，使虾青素的产量达到了9972 μg/g 细胞干重[47]。

在生产苯乙醇研究中，虽然龙舌兰、乳清等材料也用于生产[78-79]，但实际上这些材料主要是提供碳源供马克斯克鲁维酵母细胞的生长，而真正用于苯乙醇生产的仍然是L-苯丙氨酸。由于苯丙氨酸成本相对较高，利用葡萄糖等廉价的底物直接生产苯乙醇在将来可能更有潜力。Kim等成功地通过表达苯丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶两个基因实现了利用葡萄糖培养，无需添加L-苯丙氨酸生产苯乙醇，产量达1.3 g/L[80]。

4 马克斯克鲁维酵母作为构建微生物细胞工厂的平台，目前存在的问题

4.1 木糖和葡萄糖的共利用

马克斯克鲁维酵母最显著的优点是耐热性，可在较高温度下发酵，并且能利用木糖、半乳糖和阿拉伯糖，而商业化的纤维素酶的最适温度在48 ℃左右，因此最有潜力的应用是木质纤维素类生物质的同步糖化与发酵，但是由于葡萄糖的存在，其他碳源的利用会被抑制，尤其是木糖的利用同样被抑制，导致对木糖利用效率的下降。因此，研究和解决葡萄糖与木糖的共利用问题，可以促进马克斯克鲁维酵母作为微生物细胞工厂的发展。目前为止对马克斯克鲁维酵母中葡萄糖抑制效应研究的并不多，有一些报道对半乳糖、棉籽糖、蔗糖及甘油等利用的抑制和酿酒酵母类似，主要是通过HXK→SNF1→MIG1的途径[41,81]，但是马克斯克鲁维酵母中对木糖的抑制却与对其他糖的抑制不同，不是通过经典的MIG1路径[35]，具体的路径还在探索之中。我们在此研究基础上实现了葡萄糖存在时利用木糖高效生产木糖醇。由于葡萄糖和木糖共用转运蛋白，因此葡萄糖对木糖的抑制还体现在糖的转运阶段，当木糖的代谢路径中各个代谢步骤的酶由组成型启动子控制，使酵母菌株能够高效利用木糖时，仍然会受到葡萄糖的竞争性抑制[64]。我们研究组在利用马克斯克鲁维酵母生产木糖醇的研究中通过过表达木糖特异的转运蛋白ScGAL2-N376F部分解决了这个问题[3，41,69]。 但是由于在马克斯克鲁维酵母中葡萄糖对木糖利用抑制的机理研究还不够明确，彻底解决这个问题还需继续努力。

4.2抗逆性

要构建高效的微生物细胞工厂，使用的酵母细胞要有很好的抗逆性，这包括对高浓度底物和产物的耐受、对原材料中抑制物的耐受和对高温的耐受等。虽然机理还不是很清楚，马克斯克鲁维酵母具有不错的耐热特性，但是该酵母在其他方面的抗逆性上还需要进一步提高。

在生物质转化中，最吸引人的是利用木质纤维素类生物质为原料生产各种产品，但是由于木质纤维素类生物质的结构，使得酶很难快速将其水解从而释放出可发酵的糖，打开木质纤维素类生物质致密结构的前处理是不可避免的，而前处理过程中由于剧烈的物理化学条件会导致木质纤维素生物质的降解，其中六碳糖和五碳糖的破坏以及木素的降解和释放会产生弱酸、糠醛和酚类等抑制微生物生长与发酵的物质[82]。马克斯克鲁维酵母中对这些抑制物的耐受的研究比较少。虽然在其他酵母中对这些抑制物的耐受机制有一定的研究，主要是通过将抑制物降解、转化成低毒物质和排出细胞外几个途径，在马克斯克鲁维酵母中可能有类似的机理。我们的转录组研究显示马克斯克鲁维酵母在抑制物存在时，NAD+的合成和NAD(P)H合成的相关基因的表达上升，但是实际上由于对抑制物的耐受消耗还原型辅酶，导致NAD(P)H/NAD(P)+比例下降[83]。但是这些途径是如何实现的仍然很不清楚。Oliva等对单种抑制物和多种抑制物对马克斯克鲁维酵母生长与发酵的研究表明，马克斯克鲁维酵母对单种抑制物有较好的耐受性，而对于多种抑制物的耐受急剧下降[84]。我们的研究也表明马克斯克鲁维酵母对稀酸处理的玉米芯中的抑制物有一定耐受性，而且能够快速降解糠醛类抑制物[3,41]。但是K.marxianu中细胞是如何对抑制物做出反应及实现耐受的还不清楚。

高浓度的底物，尤其是可溶性糖类会导致高渗透压而抑制微生物生长发酵。马克斯克鲁维酵母中的HOG1被证实是酵母细胞对乳酸及渗透压的耐受的关键蛋白[85]，但其他方面的研究还很少。

高浓度产物也会对酵母的生长发酵产生抑制，目前的研究主要集中在乙醇对马克斯克鲁维酵母的影响。通过采用TATA结合蛋白SPT15突变体的全局转录工程(Global transcription machinery engineering，gTME)筛选到了对乙醇耐受和生产提升的突变体，但是耐受机理不明确[86]。Alvim等通过蛋白组学和代谢组学分析发现，在高浓度乙醇存在时，胞内海藻糖浓度上升，氧化应激反应上升[87]，而为了中和过多的活性氧NAD(P)H的生产也进一步提高[88]。

5 总结

马克斯克鲁维酵母作为一个生物安全的酵母菌株，具有耐热、快速增殖和利用广泛的碳源等特点，在构建微生物细胞工厂上有很多优势。例如其快速增殖能力和利用菊糖的能力在生产菊糖酶和利用菊糖方面有不少成果，而其高密度培养的能力以及强大的菊糖酶基因启动子在表达外源蛋白方面也逐渐得到应用，其利用木糖的能力和耐热的特点在利用木质纤维素生物质生产各种产品上的优势也逐渐体现，而高温发酵也可减少污染风险，为补料带来方便。但是马克斯克鲁维酵母在工业上利用时间短，遗传信息研究不够充分，在乙醇耐受、抑制物耐受上还有所欠缺。为了将来更好地在工业生产上使用，葡萄糖和木糖等碳源的共利用、产物耐受及抑制物耐受是构建微生物细胞工厂要重点解决的问题。