褪黑素对雏鸡睾丸支持细胞体外增殖的影响

许 可，赵 静，刘红羽，乔立桥，王 军*，吕文发*

（1.吉林农业大学现代农业技术教育部国际合作联合重点实验室，吉林长春 130118；2.吉林农业大学动物生产与产品质量安全教育部重点实验室，吉林长春 130118；3.吉林省德惠市畜牧局岔路口镇畜牧兽医站，吉林德惠 130300）

睾丸由曲细精管和间质组织组成，曲细精管是精子发生的场所。支持细胞（Sertoli Cell，SC）位于曲细精管的基底膜上，在睾丸发育中发挥着重要作用[1]。有研究表明支持细胞具有调节精子发生、形成血睾屏障、为生殖细胞发育提供结构和免疫及营养支持等功能[2-3]。褪黑激素（N-乙酰基-5-甲氧基色胺，Melatonin，MT）是一种主要由哺乳动物松果体合成分泌的激素[4]。有研究报道褪黑素直接作用于睾丸体细胞，局部调节间质细胞的内分泌活动，在支持细胞中，褪黑素影响细胞生长、增殖、能量代谢和氧化状态[5]。Yang等[6]研究证明，在牛支持细胞中，褪黑素上调细胞周期蛋白D1，下调P21的mRNA水平，调节细胞发育，而褪黑素对雏鸡睾丸支持细胞的作用尚未见报道。本实验利用油红O、免疫荧光法和RT-PCR法鉴定雏鸡睾丸支持细胞，利用Cell Counting Kit-8（CCK-8）、EdU和实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术检测不同浓度褪黑素处理雏鸡睾丸支持细胞48 h后，对其细胞活力、细胞增殖能力和增殖相关基因表达的影响，明确褪黑素对雏鸡睾丸支持细胞增殖的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料 雏鸡（吉林省德惠市）；胶原酶Ⅳ、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液、油红O、Triton X-100（索莱宝科技有限公司）；4%多聚甲醛（华程生物技术有限公司）；苏木精（欣华绿源科技有限公司）；BSA（AMRESCO）；vimentin 抗 体（Sigma）；褪黑素（Sigma）；BeyoClickTM EdU（碧云天生物技术有限公司）；总RNA 提取试剂Trizol、反转录试剂盒（TaKaRa）；荧光定量PCR试剂盒（上海基星生物科技有限公司）；引物合成（生工生物工程股份有限公司）。

1.2 雏鸡睾丸支持细胞提取及纯化 取20日龄健康雏鸡，处死后，获取睾丸，PBS清洗3次，在超净台内用镊子剥去白膜，将睾丸组织剪碎，PBS清洗至液体清澈；加入1 mg/mL胶原酶Ⅳ，37℃消化50 min，1 000 r/min离心3 min，弃上清液；加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化6 min，收集细胞悬液，加入完全培养液终止消化，300目细胞筛过滤；重复用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化，直至消化完全；收集过滤液，1 000 r/min离心5 min，弃上清，完全培养液重悬细胞，分入培养皿中，2 h后进行换液，37℃、5% CO2培养24 h后，利用低渗法（PBS:蒸馏水=1:2）进行细胞纯化。

1.3 油红O染色 将中皿细胞在体外培养一段时间后，弃去培养液，用PBS缓冲的4%多聚甲醛在4℃下固定细胞1 h，用PBS洗涤2次，在室温下用稀释的油红O滤液（现配现用）染色30 min。弃去染料，用60%乙醇分色5 s，自来水洗涤。将细胞用苏木精复染30 s，用自来水洗涤至蓝色，立即用光学显微镜观察，捕获图像。

1.4 免疫荧光 将1.5×105个/孔细胞在24孔板中培养24 h进行细胞爬片。将细胞用PBS洗涤3次，PBS缓冲的4%多聚甲醛室温固定15 min，PBS洗涤3次，1% Triton X-100通透液室温孵育15 min。PBS洗涤3次，1%BSA室温封闭30 min，PBS洗涤3次，加入波形蛋白抗体，4℃孵育过夜。PBS洗涤细胞6次，山羊抗兔抗体避光孵育2 h。PBS避光洗涤细胞6次，Hoechst33258避光孵育15 min。然后，用PBS避光洗涤细胞6次，封片。在多功能细胞成像仪下观察，捕获图像。

1.5 RT-PCR及琼脂糖凝胶电泳试验 采用Trizol法提取雏鸡睾丸支持细胞的总RNA，根据TaKaRa的反转录试剂盒要求，将总RNA反转录为cDNA。RT-PCR反应体系：Premix Taq 10 μL、Forward primer 0.5 μL、Reverse primer 0.5 μL、cDNA 3 μL、RNase-free H2O至20 μL。反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s；59℃退火30 s；72℃延伸1 min、35个循环；72℃彻底延伸10 min。得到PCR产物后，配制1%琼脂糖凝胶并进行电泳，在成像仪下观察，捕获图像。PCR引物见表1。

1.6 CCK-8试验 将2×104个/孔细胞接种至96孔板中，每孔加入100 μL培养液，培养24 h。褪黑素处理支持细胞48 h后，每孔加入12 μL CCK-8溶液，在培养箱内孵育2 h。使用酶标仪于450 nm波长检测OD值。

表1 基因引物序列

1.7 BeyoClickTMEdU染色 将1.5×105个/孔细胞在24孔板中培养24 h，使细胞爬片。褪黑素处理支持细胞后，加入与培养液等量的2×EdU工作液，37℃孵育2 h。去除培养液，加入PBS缓冲的4%多聚甲醛室温固定15 min，洗涤液（含3%BSA的PBS）洗涤3次。加入含0.3% Triton X-100的PBS通透液室温孵育15 min，洗涤液洗涤2次。加入Click反应液（按顺序配制后15 min内使用）室温避光孵育30 min，洗涤液洗涤3次。加入1×Hoechst 33342室温避光孵育10 min，洗涤液洗涤3次，去除洗涤液，封片。在多功能细胞成像仪下观察，捕获图像。

1.8 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）采用Trizol法提取雏鸡睾丸支持细胞的总RNA，根据TaKaRa的反转录试剂盒要求，将总RNA反转录为cDNA。实时荧光定量PCR反应体 系：2×RealStar Green Fast Mixture 10 μL、Forward primer 0.5 μL、Reverse primer 0.5 μL、cDNA 1 μL、RNase-free H2O至20 μL。反应条件：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，40个循环；退火34 s，扩增40个循环。运用 2－△△Ct方法进行数据分析。荧光定量PCR引物见表2。

表2 基因引物序列

1.9 统计分析 采用Graph Pad Prism 5.0软件进行单因素方差分析，比较各组之间的差异，数据用平均值±标准差表示，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 支持细胞的鉴定 通过油红O染色、免疫荧光染色和RT-PCR实验来鉴定体外纯化后培养的支持细胞。油红O染色（图1-A）发现，脂滴被染成红色，苏木精复染，细胞核被染成蓝色，核内见有支持细胞特有的双极小体结构。免疫荧光染色（图1-B）显示，细胞核呈蓝色，在支持细胞中特异表达的波形蛋白呈绿色，并且波形蛋白阳性细胞比例达到94%。RT-PCR结果（图1-C）显示，在支持细胞中标志基因SOX9和GATA4均表达。

2.2 CCK-8检测支持细胞活力 如图2所示，与对照组相比，1 000 nmol/L浓度褪黑素组显著增加支持细胞细胞活力（P＜0.05）。

2.3 EdU检测支持细胞增殖能力 EdU染色结果显示（图3），增殖细胞呈绿色荧光，与对照组相比，1 000 nmol/L褪黑素组增加了EdU阳性细胞比例（P＜0.01），表明褪黑素可促进支持细胞增殖。

2.4 荧光定量检测支持细胞增殖水平 如图4所示，与对照组相比，1 000 nmol/L褪黑素组PCNA、Cyclin BmRNA表达量升高（P＜0.05），不同浓度褪黑素组Cyclin D基因表达量均升高（P＜0.05），P21基因表达量下降（P＜0.05）。这些结果表明，褪黑素促进支持细胞增殖，与CCK-8、EdU检测结果一致。

3 讨 论

根据睾丸支持细胞的特征，睾丸支持细胞的鉴定方法包括H.E.染色、油红O染色、吖啶橙染色、罗丹明123染色、免疫荧光、免疫组化和RT-PCR等方法[7-9]。本实验采用油红O染色、免疫荧光和RT-PCR 3种方法进行细胞鉴定，油红O结果显示睾丸支持细胞核周围存在脂滴，细胞核内有双极小体。王帅等[7]研究表明，脂滴和双极小体均是支持细胞所特有的结构。免疫荧光结果显示94%的细胞波形蛋白阳性表达于细胞质中。在睾丸曲细精管中，波形蛋白特异地表达于支持细胞[10]。RT-PCR结果显示在支持细胞中标志基因SOX9和GATA4均表达，与李欣等[11]的研究结果一致，进一步证明纯化后细胞培养物主要为支持细胞。

睾丸支持细胞的增殖水平影响睾丸的生精功能和体积[1]。已有研究表明，褪黑素对细胞具有促增殖作用[5]，而关于褪黑素对雏鸡支持细胞增殖的影响尚未见报道。本研究发现，1 000 nmol/L褪黑素处理支持细胞48 h可显著促进细胞增殖，其表现为细胞活力、EdU阳性细胞比例和增殖相关基因表达量（PCNA、Cyclin D、Cyclin B）增加，P21的mRNA水平下降，结果表明褪黑素可以促进雏鸡支持细胞的增殖。

研究表明，褪黑素对细胞增殖和凋亡的影响依赖于其浓度、暴露时间和细胞类型[12-13]。细胞增殖核抗原（PCNA）是调节细胞增殖的标记物，主要表达于S期，细胞周期蛋白抑制剂P21通过与PCNA相互作用影响细胞周期进程[14]。Cyclin D是G0/G1到S期转变所需的细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4和CDK6的调节亚单位[15]。本研究中褪黑素可能通过调节细胞从G1到S期的进程而影响支持细胞的生长，与Li等[16]在GC-1 spg细胞中的褪黑素研究结果相同。

褪黑素的促增殖作用已在多种细胞中显示。已有研究报道，褪黑素通过核受体RORα促进单色光诱导的胸腺中T淋巴细胞的增殖[17]。同时，褪黑素可以通过褪黑素受体1a和1c促进肉鸡中单色光诱导的B淋巴细胞增殖[18]。在患有缺氧缺血性脑损伤的新生大鼠中，褪黑素还可促进内源性神经干细胞的增殖[19]。Niu等[20]研究发现，褪黑素通过激活ERK1/2信号通路从而刺激支持细胞中神经胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）的产生，促进山羊精原干细胞（SSC）的增殖。Yang等[6]研究证明，褪黑素也可调节牛支持细胞的发育和功能。此外，在小鼠精原细胞中，褪黑素通过增加金属硫蛋白-2（Mt2）的表达促进GC-1 spg细胞增殖，抑制Mt2后，褪黑素的促增殖作用被逆转，并且还证明了细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）途径参与了褪黑素促进的GC-1 spg细胞增殖[16]。Heo等[21]研究发现，在间充质干细胞中，褪黑素通过诱导SRY盒转录因子2基因的表达来促进细胞的增殖和防止细胞复制性衰老。同样，褪黑素在治疗缺氧的神经干细胞中有很重要的作用，可以增加细胞增殖，减少细胞死亡，并增强神经元细胞分化，但不影响星形胶质细胞分化[22]。这些研究都表明褪黑素对细胞具有促增殖作用，与本研究结果相同。然而，褪黑素通过多种调控机制来发挥促增殖作用，其发生的具体机制还需要进一步研究。

4 结 论

本实验成功分离培养和鉴定雏鸡睾丸支持细胞，并证明褪黑素可以促进雏鸡睾丸支持细胞体外增殖。