一株分离于含水层介质的好氧反硝化菌脱氮性能研究*

朱晓明 赵东华 阮晓红

(1.中交上海航道勘察设计研究院有限公司，上海 200120；2.南京大学地球科学与工程学院，江苏 南京 210093)

近年来，由于经济社会快速发展，工农业生产活动所产生的污废水排放量显著增加，全球范围内出现了不同程度的水体氮污染问题，如何有效脱氮成为水污染防治领域的一个热点和难点问题[1],[2]523,[3]。生物脱氮相比物理或化学脱氮方法是比较高效、经济的污水脱氮方法[4]4242,[5]。传统生物脱氮理论认为，反硝化只能在无氧或厌氧条件下进行[2]523，但近年好氧反硝化菌被不断报道，在河道[6]、湖泊[2]523,[7]、水库[8]5508、海洋[9-10]、土壤[11]、水田[12]998、湿地[13]1314等自然环境和活性污泥或生物膜反应器[14-16]、焦化废水[17]、石化污水[18]、垃圾渗滤液[19-20]、养殖废水[21]等人工环境中均有发现，包括假单胞菌属(Pseudomonas)、副球菌属(Paracoccus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、根瘤菌属(Rhizobium)、无色杆菌属(Achrobacter)和不动杆菌属(Acinetobacter)等，但浅层地下水含水层介质中的好氧反硝化菌分离和脱氮性能研究还鲜有报道。

浅层地下水极易受含氮污染物污染。已有研究发现，太湖流域多地浅层地下水存在不同程度的“三氮”污染问题[22-24]。好氧反硝化菌生长快速、适应性强、脱氮效率高[12]997，含水层介质中好氧反硝化菌的发现可为浅层地下水氮污染修复提供一种可能途径。

本研究在苏州某一受氮污染的浅层地下水含水层介质中分离、纯化得到一株好氧反硝化菌，从形态、生理生化和分子生物学等方面鉴定了该菌株，并研究了其好氧反硝化脱氮性能、生长过程及脱氮动力学，考察了脱氮性能的影响因素，为好氧反硝化菌在浅层地下水氮污染修复工程中的实际工程应用奠定基础。

1 实验材料与仪器

1.1 实验材料

菌株分离样品采自苏州某一受氮污染的浅层地下水含水层介质，位于地表以下6.5 m处，土壤为粉质黏土，现场采集样品后用无菌采样管密封保存，4 ℃条件下运回实验室。

富集培养基：KNO3，2.0 g；柠檬酸三钠，5.0 g；MgSO4·7H2O，0.2 g；KH2PO4，1.0 g；去离子水，1 L；微量元素溶液，2 mL；pH调为7.0～7.5。其中，微量元素溶液：乙二胺四乙酸二钠，57.1 g/L；ZnSO4，2.2 g/L；CaCl2，5.3 g/L；MnCl2，3.2 g/L；FeSO4，2.7 g/L；(NH4)6Mo7O24，1.0 g/L；CuSO4，1.0 g/L；CoCl2，0.9 g/L；pH 为7.0。

反硝化液体培养基：KNO3，0.72 g/L；其余同富集培养基。反硝化固体培养基另需加入2%(质量分数)琼脂。

1.2 主要仪器

SG6型便携式DO仪、PHPJ-260型便携式pH计、IL550型总有机碳(TOC)分析仪、UV2100型紫外/可见分光光度计、ZWF-1112型立式双层大容量恒温振荡器、D-37520型离心机、ALD1244型电泳仪、QuantStudio 3型实时定量聚合酶链式反应(PCR)仪。

温度、DO由DO仪测定，pH、氧化还原电位(ORP)由pH计测定，硝酸盐氮、亚硝酸盐氮、总氮分别采用紫外分光光度法、N-(1-萘基)乙二胺分光光度法、过硫酸钾氧化—紫外分光光度法测定，溶解性有机碳(DOC)经离心过滤后由TOC分析仪测定，波长600 nm处吸光度(OD600)用紫外/可见分光光度计测定。

2 实验研究方法

2.1 菌株的分离和鉴定

2.1.1 菌株分离、纯化和筛选

取10 g新鲜菌株分离样品接种于90 mL灭菌富集培养基上，28 ℃下培养3 d，然后取菌液5 mL接种于新的富集培养基上再培养3 d，重复富集3次。取1 mL富集后菌液涂于反硝化固体培养基平板上，培养3 d后将不同形态的菌落进行分离，多次分离后，将纯化的菌株接种于装有5 mL反硝化液体培养基的试管中，37 ℃下在180 r/min的恒温振荡器上振荡培养3 d，吸取少量菌液，滴加格里斯试剂、二苯胺试剂和奈氏试剂筛选好氧反硝化菌，记为菌株PJ21。

2.1.2 菌株形态和生理生化鉴定

将菌株PJ21在反硝化固体培养基上划线培养，长出单菌落后进行形态观察和生理生化特性测试[25]。

2.1.3 分子生物学鉴定

利用DNA提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit DP302)提取菌株PJ21的16S rDNA并进行扩增。采用细菌通用正向引物(27F)和反向引物(1492R)进行扩增[8]5508，构建50 μL反应体系：模板DNA 1 μL，脱氧核糖核苷三磷酸(0.2 mmol/L)4 μL，引物(0.5 μmol/L)各2 μL，10×Buffer 5 μL，MgCl2(2 mmol/L) 3 μL，Taq酶(2.5 U/μL)0.25 μL，超纯水32.75 μL。PCR 反应条件：95 ℃预变性5 min，然后进入热循环(94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环)。取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用The QuickClean Ⅱ胶回收试剂盒纯化，然后将PCR产物连接到TA载体进行克隆，委托深圳华大基因科技有限公司测序，输入GenBank数据库(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行Blast细菌基因序列同源性比对，用MEGA软件中Kimura-Parameter Distance模型计算进化距离，采用 Neighbor-Joining构建系统发育树。

2.2 脱氮性能及其影响因素研究

2.2.1 脱氮性能初探

将菌株PJ21接种于反硝化液体培养基，28 ℃、120 r/min条件下培养1 d制得种子液，将种子液以1%(体积分数)接种量接入新的反硝化液体培养基，在好氧(DO=6.9～7.8 mg/L)，初始硝酸盐氮(用KNO3配制，下同)也即总氮质量浓度276.95 mg/L，DOC(用柠檬酸三钠配制，作碳源)质量浓度1 400 mg/L，28 ℃、120 r/min条件下培养60 h，每隔一定时间取样检测总氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮、DOC及OD600。

脱氮率或DOC利用率(η，%)和脱氮速率(R，mg/(L·h))分别按式(1)和式(2)计算[26]。

η=(C1-C2) /C1×100%

(1)

R=(C1-C2) / (t2-t1)

(2)

式中：C1、C2分别为t1、t2时刻的氮或DOC质量浓度，mg/L。

2.2.2 影响因素研究

在2.2.1节的基本条件下探索了碳源类型、温度、初始pH 3个因素对菌株PJ21好氧反硝化性能的影响。碳源类型考察了琥珀酸钠、柠檬酸三钠、苹果酸钠、葡萄糖和蔗糖(初始硝酸盐氮50.00 mg/L，DOC与总氮质量比(C/N)为10，pH=7.5)；温度考察了10、20、25、30、35、40 ℃(初始硝酸盐氮50.00 mg/L，C/N=10，pH=7.5)；初始pH考察了4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0(初始硝酸盐氮50.00 mg/L，C/N=10)。影响因素研究时培养24 h，测定OD600、DOC、硝酸盐氮变化。

2.3 菌株生长及脱氮动力学研究

2.3.1 生长动力学

根据Monod方程研究微生物生长动力学[27]437,[28]16，计算菌株PJ21的最大比生长速率和Monod生长半饱和系数。

2.3.2 衰亡动力学

衰亡过程采用一级动力学方程(见式(3))来计算。

r1=K1X

(3)

式中：r1为微生物衰亡速率，mg/(L·s)；K1为衰亡速率系数，s-1；X为微生物质量浓度，mg/L，数值上通过480倍OD600估算得到。

2.3.3 硝酸盐氮降解动力学

在Monod方程中引入产率系数可得到硝酸盐氮降解速率方程并解得相关参数[27]438,[28]18。

3 结果与讨论

3.1 菌株鉴定结果

菌株PJ21的菌落形态如图1所示，菌落呈直径1～3 mm的圆形，表面光滑，球形隆起，波状边缘，颜色为淡黄色，半透明。

菌株PJ21的生理生化特性如表1所示。采用半固体穿刺法对该菌株进行需氧性和运动性测定发现，菌株能够沿着穿刺线穿透培养基扩散生长，说明菌株能够在好氧和缺厌氧条件下兼性生长、运动。

图1 菌株PJ21的菌落形态Fig.1 Morphological characteristics of bacterial colony of strain PJ21

表1 菌株PJ21的生理生化特性

分子生物学鉴定结果表明，菌株PJ21与多株假单胞菌属的门多萨菌(Pseudomonasmendocina)同源性达99%，可确定菌株PJ21为假单胞菌属的门多萨菌。

3.2 菌株好氧反硝化脱氮性能

由图2可知，硝酸盐氮在0～18 h迅速下降，尤其在0～6 h时，硝酸盐氮从276.95 mg/L降至109.05 mg/L，12～24 h时降速减缓，24～60 h时下降很慢，几乎不再下降，60 h时硝酸盐氮质量浓度为12.32 mg/L。总氮在0～18 h内变化规律和硝酸盐氮相似，18 h后基本趋于稳定。从氮的质量平衡分析，说明在通过好氧反硝化过程脱除氮的同时，也有部分硝酸盐氮转化为了菌体生长的内源氮。整个实验过程中亚硝酸盐氮质量浓度很低，为0.23～0.34mg/L，没有出现明显的亚硝酸盐氮累积现象。

图2 氮质量浓度变化Fig.2 Variation of nitrogen mass concentrations

由图3可知，0～6、0～12、0～18、0～24 h的硝酸盐氮脱氮率分别为60.62%、75.86%、87.11%、91.18%，DOC利用率分别为40.29%、55.68%、78.34%、88.67%；由图4可知，0～6、6～12、12～18、18～24 h的硝酸盐氮脱氮速率分别为27.98、7.03、5.19、1.88 mg/(L·h)。24 h后脱氮率、DOC利用率和脱氮速率都趋于稳定。培养结束(60 h)时，硝酸盐氮脱氮率为95.55%，总氮脱氮率为65.42%；整个过程硝酸盐氮的平均脱氮速率为4.41 mg/(L·h)，高于王秀杰等[4]4249报道的4.08 mg/(L·h)，黄廷林等[8]5509报道的0.06～0.07 mg/(L·h)，冶青等[12]1001报道的1.05 mg/(L·h)。

图3 脱氮率和DOC利用率Fig.3 Efficiencies of nitrogen removal and DOC utilization

图4 硝酸盐氮脱氮速率Fig.4 Denitrification rates of nitrate nitrogen

3.3 脱氮性能影响因素探究

3.3.1 碳源类型的影响

如图5所示，菌株PJ21在以柠檬酸三钠、琥珀酸钠、苹果酸钠、葡萄糖和蔗糖为碳源时均能生长，但存在明显差异。以柠檬酸三钠为碳源时，菌株PJ21的硝酸盐氮脱氮率、DOC利用率最高，分别为81.24%、60.31%；其次是以葡萄糖为碳源时，硝酸盐氮脱氮率、DOC利用率分别为20.86%、32.09%；琥珀酸钠、蔗糖和苹果酸钠为碳源时，硝酸盐氮脱氮率、DOC利用率较低。可见，菌株PJ21的最佳碳源为柠檬酸三钠。

图5 碳源类型对菌株PJ21的影响Fig.5 Effect of carbon sources on strain PJ21

3.3.2 温度的影响

温度通过影响微生物体内酶活性从而影响脱氮效率[12]999。由图6可见，不同温度下菌株PJ21的生长和硝酸盐氮脱氮率具有明显差异，10～30 ℃时随着温度上升脱氮率和OD600升高；而30～40 ℃时随着温度上升脱氮率和OD600下降。菌株PJ21生长的适宜温度为25～35 ℃，最适温度为30 ℃。

图6 温度对菌株PJ21的影响Fig.6 Effect of temperature on strain PJ21

3.3.3 初始pH的影响

由图7可知，不同初始pH条件下菌株PJ21的生长和硝酸盐氮脱氮率存在显著差异。当初始pH为4.0～7.0时，随着初始pH增大脱氮率和OD600增加；而当初始pH为7.0～9.0时，随着初始pH增大脱氮率和OD600下降。菌株PJ21生长较适宜的初始pH为6.0～8.0，最适初始pH为7.0，与陈玲等[13]1319报道的假单胞菌属适宜初始pH相近。

3.4 菌株PJ21的生长及其脱氮动力学参数计算结果

由图8(a)的OD600和DOC变化曲线可知，菌株

图7 初始pH对菌株PJ21的影响Fig.7 Effect of initial pH on strain PJ21

图8 菌株PJ21生长过程分析Fig.8 Process of growth analysis of strain PJ21

PJ21的生长迟缓期很短，很快速进入了对数增长期，生长稳定期也较短，而衰亡期较长。由图8(b)可知，反硝化液体培养基的pH和ORP在迟缓期和衰亡期内变化很小，而在对数增长期和生长稳定期内发生显著变化。

菌株PJ21的最大比生长速率和Monod生长半饱和系数分别为4.30×10-4s-1、142.99 mg/L。衰亡速率系数为7.90×10-5s-1(R2=0.991，说明适合采用一级动力学方程拟合)。硝酸盐氮降解过程的产率系数为1.26。

4 结 论

(1) 从受氮污染的浅层地下水含水层介质中分离、纯化得到一株好氧反硝化细菌PJ21，经形态、生理生化及分子生物学鉴定确定其为假单胞菌属门多萨菌。

(2) 菌株PJ21具有高效好氧反硝化能力，能够在短时间内实现快速反硝化脱氮，培养60 h后总氮、硝酸盐氮脱氮率分别可达65.42%、95.55%，最大硝酸盐氮脱氮速率可达27.98 mg/(L·h)，平均脱氮速率为4.41 mg/(L·h)，且不会有明显的亚硝酸盐氮累积现象。

(3) 菌株PJ21的最佳碳源为柠檬酸三钠；适宜生长温度为25～35 ℃，最适温度为30 ℃；适宜生长的初始pH为6.0～8.0，最佳为7.0。

(4) 菌株PJ21生长迟缓期和稳定期均较短，能够快速进入对数增长期，但衰亡期较长；最大比生长速率和Monod生长半饱和系数分别为4.30×10-4s-1、142.99 mg/L，衰亡速率系数为7.90×10-5s-1，硝酸盐氮降解过程的产率系数为1.26。