SIRT5通过去琥珀酰化SHMT2促进肿瘤细胞增殖

沈 潮，李超群，魏 珍，陈昕媛，余 巍

(复旦大学 生命科学学院，上海 200438)

某些氨基酸代谢过程中产生的只含有一个碳原子的基团，称为一碳单位(one carbon unit).通常一碳单位不能单独游离，需要通过和叶酸化合物四氢叶酸(TetraHydroFolic acid, THF)结合来参与生物代谢[1].一碳单位代谢中的各种生物化学反应均以循环的方式进行，在此过程中，一碳单位会转移并参与到其他代谢途径，并由其他来源进行补充.值得注意的是，针对叶酸代谢及其下游核苷酸代谢的抑制剂已在化疗中应用长达60多年，如今部分肿瘤治疗仍会通过选择叶酸的抑制剂来降低恶性细胞的增殖[2-3].

近年来，人们对肿瘤相关代谢机制的研究日益加深，丝氨酸羟甲基转移酶(Serine HydroxylMethyl Transferase, SHMT)作为一碳单位代谢和丝氨酸代谢通路中的关键酶之一，催化线粒体中THF和5,10-meTHF之间的转换，在调节肿瘤细胞代谢中发挥重要作用.SHMT在肿瘤病患体内呈现异常高表达状态.SHMT存在两个亚型，分别为蛋白SHMT1和SHMT2.其中，SHMT1负责编码胞质同工酶，参与了胸苷酸的从头合成途径[4]；SHMT2则负责编码线粒体同工酶，参与了线粒体胸腺嘧啶核苷单磷酸酯(Deoxyadenosine Triphosphate, dTMP)的合成[5].

众多临床数据显示，目前许多癌症包括肾癌、膀胱癌、结直肠癌以及中枢神经系统相关癌症中SHMT2蛋白表达增高，但SHMT1亚型蛋白表达量正常[6-7]，并且我们可以通过SHMT2的表达量确定肿瘤的生长状况并预测预后[8-9].然而，SHMT2如何影响肿瘤细胞代谢和肿瘤增殖，机制尚不清楚.有报道指出，乳腺癌中缺氧诱导因子-1α(Hypoxia Inducible Factor-1α, HIF-1α)和癌基因C-MYC的协同作用，上调病患体内SHMT2蛋白的表达量，同时增强了氧化还原反应，促进提升癌细胞在缺氧环境下的生存能力[7].

而在本文中我们发现，SHMT2能够被SIRT5去琥珀酰化修饰.琥珀酰化修饰是新发现的一种蛋白翻译后修饰，且近年来该研究领域发展迅速.SIRT5作为Sirtuins家族里的一员于1999年被Frye等首次发现[10]，它也是家族中第一个被发现除了NAD+依赖的去乙酰化活性外，还具有水解赖氨酸上琥珀酰、丙二酰及戊二酰基团的能力[11].SIRT5蛋白大部分位于线粒体内，且广泛表达在胎儿或成人的心脏、肌肉、脑、肾脏、肝脏等组织中[12].该蛋白在人体内的广泛表达也暗示其对于线粒体蛋白的调控有着至关重要的作用.SHMT2也主要定位于线粒体，是线粒体内的磷酸吡哆醛(Pyridoxal Phosphate, PLP)结合蛋白，发现其可以保护线粒体DNA，使其免受尿嘧啶积淀的影响[13].

本研究中，我们发现SIRT5能与SHMT2相互作用并调控其琥珀酰化修饰与酶活，且K181位赖氨酸为其主要的琥珀酰化位点.同时发现高浓度的甲氨蝶呤(Methotrexate, MTX)能通过抑制体内SIRT5表达量上调SHMT2蛋白的琥珀酰化修饰，抑制SHMT2酶活，从而起到抑制癌细胞代谢的作用.

1 材料与方法

1.1 材料及相关试剂

HEK293T细胞株源于本实验室，结直肠癌HCT116细胞株源于上海交通大学附属新华医院，DMEM高糖培养基购自HyClone公司，SIRT5和Succinylated-lysine抗体购自Cell Signaling Technology公司，SHMT2抗体购自Santa Cruz公司，KOD-plus定点突变试剂盒购自日本东洋纺公司，烟酰胺购自Sigma公司，甲氨蝶呤购自美国APExBIO公司，质粒小抽试剂盒购自天根生物科技公司.

1.2 细胞转染

本实验室采用PEI试剂进行转染，以10cm培养皿的HEK293T细胞为例，当细胞密度达到70%时即可进行转染.在1.5mL小管中依次加入1mL DMEM培养基、5μg质粒及15μL PEI，吹打混匀后，室温静置15min.将混合液均匀加入培养皿中，十字形晃动培养皿后，放入培养箱中孵育.6h后换液，48h后收样处理.

1.3 免疫共沉淀

除尽细胞培养基后，4℃预冷PBS溶液洗涤3次.加入1mL 0.4%NP40裂解液，置于4℃水平摇床中慢速孵育20min.充分吹打裂解，收集裂解液于小管中，4℃，12000r/min，离心15min.取50μL上清液作阳性对照，加入10μL 6×SDS上样缓冲液，95℃加热8min，待用.在剩余上清液中加入10μL已偶联抗体的磁珠，4℃旋转2h后，4℃，2000r/min，离心2min，去上清.加入0.4%NP40裂解液，混匀后4℃，2000r/min，离心2min，重复3次.加入80μL 1×SDS上样缓冲液，95℃加热8min，待用.

1.4 免疫印迹法

配胶，上层胶浓度为5%，下层胶浓度为12%.加入电泳缓冲液后上样，80V恒压30min，将电压调至120V电泳1.5h.300mmol/L恒流湿转60min.用5%BSA(1×TBST)溶液室温封闭1h.一抗孵育4℃摇床过夜或室温摇床1h.回收一抗，1×TBST溶液洗膜，快摇5min，重复3次.加入相应属性二抗，室温孵育1h.回收二抗，洗膜3次后进行显影记录.

1.5 SHMT2酶活检测[14]

酶活反应液配方: 50μmol/L PLP，25mmol/L Na2SO4，1mmol/L EDTA，50mmol/L DL-β-苯基丝氨酸，50mmol/L Hepes pH8.0.将野生型SHMT2及其突变体或者与SIRT5作用后的SHMT2加入上述反应液中，置于96孔板中，检测279nm处的信号强度.

1.6 统计分析

利用Graphpad Prism软件统计样本，并对结果进行双尾t检验分析，最终以柱形图的形式呈现.其中，所有数据的处理都遵循SEM分析法(mean±SD).P<0.05被认为符合统计学意义，*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001，****代表P<0.0001.

2 结 果

2.1 SIRT5能与SHMT2在体内相互作用

首先，我们在pcDNA3.1b(-)载体上构建带有flag标签的SIRT5表达质粒，并转染至HEK293T细胞中.48h后，收集细胞并进行裂解收样，使用Flag M2 beads进行免疫共沉淀实验.实验结果显示，外转Flag-SIRT5和内源SHMT2存在明显互作.同理，使用带有Flag-SHMT2质粒也被证明能和内源SIRT5发生相互作用(图1).

2.2 SHMT2可被SIRT5去琥珀酰化修饰，并降低酶活

由于SIRT5是去酰化修饰酶，具备去琥珀酰化，去丙二酰化和去戊二酰化活性，且这些蛋白翻译后修饰的过程是可逆的，烟酰胺(Nicotinamide, NAM)作为SIRT5去酰化修饰产物，能够反馈抑制去酰化修饰的发生，故使用NAM处理细胞，以确定SHMT2能够被酰化修饰.通过包装慢病毒感染HEK293T细胞，我们构建了表达Flag-SHMT2的稳定细胞系.用500μmol/L NAM处理该稳定株后发现，在8h内，随着时间的增加，SHMT2琥珀酰化水平不断提高，而丙二酰化和戊二酰化却无明显变化趋势(图2(a)).因此，确定SHMT2能够被琥珀酰化修饰.

继而，我们将Flag-SHMT2和HA-SIRT5共转于HEK293T细胞中，经Western blot验证，SIRT5能去琥珀酰化SHMT2蛋白(图2(c)).同时，为了验证SHMT2蛋白的琥珀酰化对其酶活的影响，我们使用DL-β-苯基丝氨酸作为SHMT2酶活反应底物检测其酶活，发现NAM处理会降低SHMT2酶活性，而SIRT5则能显著提升其酶活性(图2(b，d)).这证明了SHMT2的琥珀酰化修饰会抑制本身的催化活性.

2.3 K181是SHMT2主要的琥珀酰化修饰位点

为寻找SHMT2蛋白上的琥珀酰化修饰位点，通过检索文献中的质谱数据并比较不同物种之间的同源性，确定了最有可能的9个琥珀酰化赖氨酸修饰位点，分别是K103，K181，K269，K302，K409，K459，K464，K469，K474等[15].利用NCBI网站进行同源性比对，发现这预测的9个位点在人、牛、斑马鱼、鼠、黑猩猩等物种中的保守性较高(图3(a)).

首先，为进一步确认SHMT2蛋白的主要琥珀酰化位点，我们将这些位点上的赖氨酸K分别突变为谷氨酸E(模拟琥珀酰化修饰)和精氨酸R(模拟去琥珀酰化修饰)，并检测相应突变蛋白的琥珀酰化修饰水平和酶活.实验表明： 与野生型SHMT2蛋白相比，K181E突变蛋白的琥珀酰化水平及酶活均显著降低(图3(b)).虽然K269E，K302E，K469E等3个位点的琥珀酰化修饰均有所下调，但其相应酶活却显著升高(图3(b))，所以，综上，我们初步确定K181位点是SHMT2蛋白的主要琥珀酰化位点.

其次通过实验发现，与野生型相比，SHMT2突变蛋白K181E及K181R的酶活在体外显著性降低(图3(c)).同时，在测定酶活的反应液中分别加入HA-SIRT5或NAM，我们发现野生型的SHMT2蛋白酶活会分别显著性地提升及降低，而K181E和K181R两个突变蛋白的酶活却基本没有发生改变(图3(c))，表明SHMT2的181位点突变之后，其酶活不再受SIRT5和NAM影响，进一步证明第181位赖氨酸是SHMT2的主要琥珀酰化修饰位点.值得注意的是，在加入SIRT5之后K181R酶活显著降低(图3(c))，这可能是SHMT2存在其他位点受SIRT5调控.K181E突变体酶活较低(～0.2)，故过表达SIRT5之后酶活无进一步的明显变化；而K181R酶活较高(～0.5)，故对K181R的影响较大.

2.4 甲氨蝶呤影响SHMT2琥珀酰化修饰

甲氨蝶呤(MTX)是一种临床使用的化疗药物，作为叶酸拮抗剂，能有效抑制二氢叶酸还原酶，阻断一碳代谢通路，抑制肿瘤的生长发育.我们采用结直肠癌细胞HCT116进行试验，以便更好地观察MTX在肿瘤细胞中能否通过调控SHMT2蛋白的琥珀酰化阻断肿瘤细胞的生长.

我们分别按照0，0.004，0.008，0.020，0.060及0.100μmol/L的MTX浓度处理HCT116细胞24h，发现细胞内SHMT2蛋白表达量未发生任何改变，且SIRT5蛋白在低浓度的MTX(<0.060μmol/L)处理下表达量随着浓度增加而不断增加.当MTX浓度高于0.1μmol/L时，细胞状态很差，几乎不能存活，而在0.100μmol/L浓度MTX处理下，SIRT5蛋白水平(SIRT5/Tubulin: 3.06)只有0.060μmol/L浓度MTX处理下(SIRT5/Tubulin: 6.61)的一半，因此我们认为，SIRT5表达水平在MTX浓度高于0.060μmol/L时显著下降(图4(a)).这也就说明了MTX药物本身不会影响肿瘤细胞内源SHMT2表达量，那么很有可能是通过调控SIRT5的表达水平，进而影响SHMT2的琥珀酰化修饰和酶活.进一步的实验结果表明，SHMT2蛋白的琥珀酰化修饰水平在低浓度MTX(<0.060μmol/L)处理下呈下降趋势，在高浓度MTX(<0.060μmol/L)处理下呈上升趋势，这也和上述SIRT5表达量的变化相符(图4(b)).

值得注意的是，SHMT2的琥珀酰化会降低蛋白本身酶活，从而抑制相关肿瘤细胞的生长增殖.而实验结果表明： MTX浓度大于0.060μmol/L时，才会降低癌细胞内SIRT5蛋白量，提升SHMT2的琥珀酰化程度.而在MTX浓度小于0.060μmol/L时，MTX反而会随着浓度提升而降低SHMT2的琥珀酰化程度，我们认为，很有可能是低浓度的MTX通过上调SIRT5-SHMT2的调控从而促进了肿瘤细胞的增殖，这也为临床上单独用低浓度MTX在结直肠肿瘤病人的治疗中产生耐药性提供了解释.而当浓度提升到一定程度(>0.06μmol/L)之后，才会通过抑制SIRT5表达量提高SHMT2琥珀酰化修饰，抑制肿瘤的增殖，但这样高浓度的MTX化疗对病人也会产生较大的伤害.

3 讨 论

作为组蛋白去乙酰化酶Sirtuins家族里的成员之一，SIRT5具有多种去酰化酶活性，包括了去琥珀酰化，去戊二酰化及去丙二酰化.这3种蛋白翻译后修饰的底物均被证实主要存在于细胞线粒体中，暗示SIRT5可通过调控线粒体相关蛋白的翻译后修饰影响其功能.近来有研究表明，SIRT5能通过修饰某些代谢通路上的关键蛋白来调控细胞的代谢生长，包括糖酵解，脂肪酸氧化及尿素循环等[16].

虽然丝氨酸和甘氨酸属于非必需氨基酸，但它们在肿瘤相关细胞中却行使着必不可少的功能.丝氨酸代谢会为生产还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Reduced Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate, NADPH)和嘌呤提供所需的一碳代谢单位，促进肿瘤快速增长，加快肿瘤细胞内DNA与RNA的合成代谢，从而减少细胞活性氧水平[17-18].每当癌细胞迁移至新的病灶区时，都会面临低葡萄糖与低丝氨酸环境，癌细胞因此会重编程其代谢途径，从而克服环境障碍，最终成功转移病灶.

据报道，SIRT5通过调节关键蛋白的翻译后修饰在丝氨酸代谢中起作用[19-20]，而SHMT2蛋白作为一碳单位代谢和氨基酸代谢沟通的桥梁，能和SIRT5发生内源相互作用，并且其琥珀酰化修饰水平也受到SIRT5调控[21].SHMT2不仅能催化丝氨酸转化成甘氨酸，同时也会生成重要中间体5,10-亚甲基四氢叶酸(5,10-CH2-THF)[22-24].近年来，多项研究表明SHMT2蛋白的过表达会抑制PKM2酶活，降低细胞的耗氧量水平[25-27].但是截至目前，SHMT2蛋白翻译后修饰的调控机制尚不明确.值得注意的是，有实验证明SHMT2能被SIRT3去乙酰化修饰，且SHMT2确实能和SIRT3相互结合[14].SIRT3和SIRT5通常被认为是线粒体内蛋白翻译后修饰的关键调控酶，且赖氨酸乙酰化及琥珀酰化位点在绝大多数蛋白上都有所重叠，例如柠檬酸合酶(Citrate Synthase, CS)及重组人17β-羟基类固醇脱氢酶(Recombinant Human Hydroxysteroid (17-beta) Dehydrogenase 10, HSD17B10)[28].在本文中，我们验证了SIRT5和SHMT2能够相互作用，利用酶活实验确定了SHMT2第181位的赖氨酸是其主要琥珀酰化位点.

一般情况下，细胞中多数SHMT2蛋白会在未激活状态下形成二聚体.通过类比于PKM2，为了激活SHMT2，我们猜想其会在K181位点结合PLP后经过转化形成四聚体，这也有待后续实验的证实.蛋白质组学研究显示，SHMT1也能被琥珀酰化，且SHMT1和SHMT2存在同样的保守的氨基酸序列.因此，SHMT1的一些功能SHMT2也可能会拥有，这为后续针对SHMT2更深入的实验探究提供了一定的方向.

同时突变蛋白SHMT K181E相比于野生型SHMT2酶活降低，表明K181位点很可能是一个潜在肿瘤治疗位点.有文献证明，SHMT2在细胞增殖和T细胞激活上存在某种关联[29].而将第181位赖氨酸突变为谷氨酸的特异性单氨基酸突变技术可用于抑制与SHMT2相关的肿瘤，这为肿瘤病患提供了潜在的治疗手段.

我们的研究结果表明，SHMT2的去琥珀酰化程度越高，自身酶活也就越高.这从另一角度说明SIRT5可能是促进肿瘤细胞生长的潜在致癌基因.但是关于SIRT5在肿瘤发生发展中起到的调控作用及机制还有待深入研究.近期研究表明，异柠檬酸脱氢酶1(Isocitrate Dehydrogenase 1, IDH1)突变体诱导的异常高琥珀酰化修饰会破坏线粒体功能，外源SIRT5的引入则会抑制高琥珀酰化肿瘤细胞的增殖[30].综上所述，SIRT5在调控不同代谢通路酶的过程中，会表现出不同的去酰化功能.因此，SIRT5在肿瘤发生发展中起到的作用和其所在细胞环境息息相关，在某些特定的情况下，被调控的通路决定了对肿瘤生长的促进或抑制.

有研究报道，降低细胞内丝氨酸和甘氨酸浓度会影响野生型HCT116细胞的增殖[31].我们猜想，由于SHMT2 K181E突变体酶活显著降低，对丝氨酸的代谢可能会减弱，从而使细胞处于丝氨酸/甘氨酸饥饿状态.因此，SHMT2 K181E可能会致使丝氨酸/甘氨酸饥饿，从而降低肿瘤的生长繁殖速度，这一猜想仍需进一步的实验验证.与此同时，本实验中还利用了临床上广泛运用的化疗药物，叶酸抑制剂MTX处理结直肠癌HCT116细胞，发现在高浓度MTX处理环境下，细胞内SIRT5蛋白表达量明显降低，SHMT2的琥珀酰化显著升高，从而降低了SHMT2的酶活，最终抑制了肿瘤的繁殖.我们从另一个角度解释了MTX能够阻断肿瘤生长的原因，但高浓度MTX化疗对病人也有较大伤害.然而有趣的是，在低浓度的MTX处理下，SIRT5的表达量呈现一个小幅度上升趋势，猜想可能是低浓度MTX会通过激活SIRT5-SHMT2而产生药物耐受，这也为临床上单独用低浓度MTX在结直肠肿瘤病人的治疗中产生耐药性提供了解释，提示我们临床上可以通过低浓度MTX和干预SIRT5-SHMT2来共同治疗结直肠肿瘤疾病.

综上，我们的研究阐明了SIRT5去琥珀酰化SHMT2，增强其酶活的分子机制，拓展了对于SIRT5和SHMT2在调控肿瘤发生发展中的认识，并为相关肿瘤治疗提供了新的思考.