孕期酒精暴露致DNA 甲基化异常对子代小鼠心脏发育相关基因表达的影响

罗孝美，韩笑，彭昌，邓玲，黄丽欣

孕期饮酒可致胎儿酒精综合征，心脏发育畸形便是该综合征较为严重的畸形之一[1-2]。但遗憾的是，酒精暴露致心脏发育异常的机制仍不清楚。本课题组前期研究证实[3-4]，组蛋白乙酰化修饰失衡参与介导了孕期酒精暴露致胎鼠心脏发育异常；但组蛋白乙酰化修饰失衡并不能完全解释酒精暴露致心脏发育畸形。近年研究证实[5-6]，DNA 甲基化是表观遗传中的另一种重要修饰方式直接参与了心脏发育的调控。之前本课题组另一项研究也证实组蛋白甲基化和乙酰化交互调控在心脏发育过程中发挥了重要调控作用[7]。因此，推测在酒精暴露致心脏发育异常的过程中甲基化修饰失衡可能也发挥了重要调控作用。故本研究以DNA 甲基化修饰为切入点探讨孕期酒精暴露对心脏发育相关基因表达水平的影响，希望对孕期饮酒致子代心脏发育异常的防治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

选取健康性成熟SPF 级昆明小鼠作为研究对象，昆明小鼠购置于重庆医科大学，按雌 :雄=2 :1合笼，次晨发现阴栓雌鼠胎龄记为0.5 d。将孕鼠按照随机数字表法随机分为4 组：正常组、对照组、酒精组、干预组，每组6 只。在胎龄 0.5 d～16.5 d期间，酒精组每日给予56%酒精5 ml/kg 灌胃1 次，干预组在给予56%酒精的基础上每日腹腔注射1次DNA 甲基转移酶（DNMT）特异性抑制剂5-氮杂胞苷（2.5 mg/kg），对照组予等量生理盐水灌胃及等量二甲基亚砜（DMSO）腹腔注射，正常组未给予任何处理。

1.2 小鼠心脏标本制备

至孕期16.5 d，二氧化碳麻醉处死孕鼠，剖开腹腔找到串珠样子宫取出胚胎并收集胎龄16.5 d 胎鼠心脏放入-80℃冰箱保存备用。

1.3 主要仪器及试剂

荧光定量PCR仪（Bio-Rad，CFX96，美国），Agena MassArray DNA 质谱分析系统（Agena Bioscience，美国），抗心肌肌钙蛋白T（cTnT）、β-肌球蛋白重链（β-MHC）单克隆抗体（Abcam，英国），抗心房利钠肽（ANP）抗体（Santa Cruz，美国），β-actin 兔来源多克隆抗体（中杉金桥，北京），辣根过氧化物酶（hHRP）标记山羊抗兔的二抗（中杉金桥，北京），DNA 提取试剂盒（BioTeke，北京百泰克生物技术有限公司），荧光定量PCR 试剂盒（Takara，大连宝生物工程有限公司），DNA 提取及纯化试剂盒（Solarbio，北京索莱宝科技有限公司），DNMT 测定试剂盒（GENMED，美国）。

1.4 实验方法

1.4.1 心肌组织DNA 提取及纯化

胎鼠心肌组织使用液氮研磨成粉末状，再用酚抽提法即可得到基因组DNA。实验步骤严格按照试剂盒操作说明进行。

1.4.2 DNA 甲基转移酶活性测定

参照文献报道[8]运用DNMT 测定试剂盒检测胎鼠心肌组织中DNMT 活性，运用OD=450 nm 波长酶标仪检测，严格按照试剂盒说明操作。DNMT 活性[OD/（h·mg）]=（样品OD-空白OD）×1 000/[样品蛋白量（μg）×孵育时间（h）]。

1.4.3 心脏核心转录因子心肌细胞增强因子2A 启动子区DNA 甲基化测序

参照文献报道甲基化测序方法[9]，整理待检测CpGs 序列信息成标准格式，将目的序列输入到EpiDesigner 软件进行引物设计，合成引物。通过酶标仪及凝胶电泳检测DNA 浓度及纯度。NaHSO3处理待测DNA 样本。对DNA 样本进行PCR 扩增反应、虾碱酶（SAP）消化反应、转录和酶切反应。树脂纯化后通过Agena MassArray 系统（Agena Bioscience，美国）检测DNA 甲基化。根据含G 峰和含A 峰的面积比较，计算出待检样品甲基化及非甲基化程度，属于两者相对定量比值，检测所得的原始数据，即代表该样品中对应甲基化位点的甲基化程度。

1.4.4 染色质免疫共沉淀

取胎鼠心脏组织30 mg，预冷磷酸缓冲液清洗后加入终浓度为1 %的甲醛交联。超声切割DNA至200 bp～1 000 bp 之间。加入染色质免疫共沉淀（ChIP）级抗心肌细胞增强因子（MEF2A）抗体4 ℃摇床过夜沉淀DNA 片段和蛋白质复合物，65 ℃水浴逆转交联6 h～ 8 h，纯化和回收DNA 片段。用核酸蛋白测定仪测定A260 nm/A280 nm 比值，以确定ChIP 后DNA 的浓度及纯度，进行PCR 扩增。

1.4.5 蛋白免疫印迹法

提取胎鼠心肌组织核蛋白，8 % SDS-PAGE 凝胶分离核蛋白，PVDF 膜半干转膜后，5 %脱脂牛奶封闭2 h 后分别加入兔来源抗ANP、cTnT、β-MHC单克隆抗体（1：1 000）及β-actin 兔来源多克隆抗体（1：1 000）4 ℃孵育过夜，TBST（100 mmol/L Tris·HCl，150 mmol/L NaCl，20% Tween 20，pH7.4）洗涤3 次，每次15 min，然后加入h HRP 标记山羊抗兔的二抗（1：5 000）脱色摇床上孵育2 h，TBST 洗涤3 次，每次15 min，运用Bio-Rad 图像分析仪进行图像扫描；采用Quantity One 4.4 软件进行分析。

1.4.6 实时荧光定量PCR 引物序列和退火温度

针对MEF2A 基因CDS 核心编码区设计特异性引物，引物用Primer Premier 5.0 软件设计，由大连宝生物公司合成。将MEF2A 基因产物进行梯度稀释，运用Bio-Rad CFX96 实时荧光定量PCR 仪扩增，做出标准曲线，得到R2值和扩增效率。引物序 列：MEF2A(F)5'-CAGGTGGTGGCAGTCTTGGA-3'，MEF2A(R) 5'-TGCTTATCCTTTGGGCATTCA-3'，产物大小：160 bp。反应条件：预变性：95 ℃ 30 s，变性：95 ℃ 5 s，退火延伸：58 ℃ 30 s，39 个循环。选取β-actin 作为内参。数据用Bio-Rad CFX96 实时荧光定量PCR 仪自带基于pfaffl 原理的相对定量数据分析软件分析。

1.5 统计学处理

所有数据应用SPSS 18.0 软件进行统计分析，连续性变量用均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组间比较进行单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

胎鼠心肌组织中DNMT 活性（表1）：比色法结果显示，胎鼠心肌组织中DNMT 活性在酒精组和DNMT 抑制剂5-氮杂胞苷干预组较对照组和正常组显著降低，差异具有统计学意义（均P＜0.05），而对照组较正常组DNMT 活性未见明显变化，两组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 孕期酒精暴露对胎鼠心脏发育相关基因表达水平及DNMT 活性的影响a（）

表1 孕期酒精暴露对胎鼠心脏发育相关基因表达水平及DNMT 活性的影响a（）

注：a：除比较胎鼠心脏核心转录因子MEF2A 启动子区DNA 甲基化水平为各组3 只胎鼠外，余者均为6 只。DNMT：DNA 甲基转移酶；MEF2A：心肌细胞增强因子2A；mRNA：信使RNA；ANP：心房利钠肽；cTnT：心肌肌钙蛋白；β-MHC：β-肌球蛋白重链。与对照组和正常组相比*P＜0.05

心脏发育核心转录因子MEF2A 启动子CpG 岛DNA 甲基化水平（表1、图1）：心脏发育核心转录因子MEF2A 启动子区CpG 岛测序结果表明，酒精组和干预组小鼠心脏核心转录因子MEF2A 启动子+75 bp 和+325 bp DNA 甲基化水平较对照组和正常组显著降低，差异有统计学意义（P 均＜0.05）。

图1 胎鼠心脏核心转录因子MEF2A 启动子区DNA 甲基化检测凝胶图和圆点图（n=3）

心脏核心转录因子MEF2A mRNA 水平（表1）：实时荧光定量PCR 结果显示：酒精组和干预组小鼠心肌组织中心脏核心转录因子MEF2A mRNA 水平较对照组和正常组显著升高，差异有统计学意义（P 均＜0.05）。

心脏核心转录因子MEF2A 对心脏发育结构基因的调控作用（图2）：ChIP 结果表明，小鼠心脏核心转录因子MEF2A 能够结合到心脏发育相关结构基因ANP、cTnT 及β-MHC 启动子区域，因而可能直接参与上述基因的转录调控。

心脏结构基因ANP、cTnT 和β-MHC 的表达水平（表1、图3）：蛋白免疫印迹法结果显示，与对照组和正常组相比，酒精组和干预组的心脏结构基因ANP、cTnT 及β-MHC 的蛋白表达水平显著升高，差异有统计学意义（P 均＜0.05）。

图2 染色质免疫共沉淀分析胎鼠心脏核心转录因子MEF2A对心脏结构基因启动子的结合作用（n=3）

图3 Western blot 分析各组胎鼠心脏发育结构基因ANP、cTnT 和β-MHC 的蛋白水平（n=6）

3 讨论

孕期饮酒可以导致胎儿心脏发育畸形，但具体机制不清楚。小鼠心脏发育过程与人类非常相似，故本研究通过酒精暴露孕期小鼠来探讨酒精对小鼠心脏发育的影响。实验结果发现酒精暴露的子代小鼠心脏组织中DNMT 活性较对照组显著减低，DNA 甲基化测序结果也发现心脏核心转录因子MEF2A 启动子区甲基化水平在酒精组和干预组均显著降低，为了进一步证实甲基化变化在酒精暴露小鼠心脏中的作用，给予DNMT 抑制剂5-氮杂胞苷干预，结果也证实在子代小鼠心肌组织中DNMT活性和心脏核心转录因子MEF2A 启动子区甲基化水平在干预组显著降低，其变化趋势与酒精暴露组的变化趋势相一致。此外，实时荧光定量PCR 结果也进一步证实心脏核心转录因子MEF2A 的转录水平在酒精暴露组及干预组显著升高。这些结果均提示酒精介导的DNA 低甲基化可能参与了心脏核心转录因子MEF2A 的转录调控。心脏发育结构基因的正确表达是构建完美心脏的基础，心脏发育结构基因包含较多，如ANP、β-MHC、cTnT、cTnI、α-MHC、Cx43 等。本课题组前期研究[3-4,10]发现，ANP、β-MHC、cTnT 这几个基因在酒精暴露及心肌肥厚的小鼠心肌组织中其表达水平出现明显异常，提示这些基因与病理性心脏疾病中可能发挥重要作用。在本研究中检测的ANP、β-MHC、cTnT的表达水平在酒精组和干预组均显著升高，其变化趋势与心脏核心转录因子MEF2A 启动子DNA 甲基化水平相对应。转录因子是调控基因转录的关键因子，参与众多基因的转录调控。ChIP 结果证实，心脏核心转录因子MEF2A 能够结合到心脏结构基因ANP、β-MHC、cTnT 启动子区参与这些基因的调控。因此，上述结果表明DNMT 介导的DNA 甲基化修饰失衡可能是孕期酒精暴露致子代小鼠心脏发育相关基因表达异常的重要调控因素。心脏发育是十分复杂而精细的过程，任何微小的变化均会导致心脏发育异常[11-14]。国外研究证实[6,15-16]，甲基化修饰参与了哺乳动物的心脏发育过程，且经酒精干预的小鼠心脏组织中发现甲基化修饰异常。因此，本研究结果与国外研究相一致。但本研究仅检测了一部分心脏发育相关基因，其他心脏发育相关基因的表达情况如何以及是哪些DNMT 亚型在其中发挥关键调控作用仍有待进一步研究证实。