茵陈饮片与茵陈标准汤剂的质量比较研究△

田芳，阮群珈，石星，吴孟华，张英，曹晖，马志国*

1.暨南大学 岭南传统中药研究中心，广东 广州 510632； 2.国家中药现代化工程技术研究中心 岭南资源分中心，广东 广州 510632； 3.暨南大学 药学院，广东 广州 510632； 4.乌鲁木齐质量计量检测研究院，新疆 乌鲁木齐 830000

茵陈为菊科植物滨蒿ArtemisiascoparzaWaldst.et Kit.或茵陈蒿ArtemisiacapillarisThunb.的干燥地上部分，春季采收的习称“绵茵陈”，秋季采割的称“花茵陈”。味苦、辛，性微寒，具有清利湿热、利胆退黄的功能，临床用于黄疸尿少、湿温暑湿、湿疮瘙痒[1]。“绵茵陈”为临床常用的饮片规格，其主要含有绿原酸、咖啡酸为代表的有机酸类成分[2-3]，《中华人民共和国药典》2015年版一部茵陈项下规定“绵茵陈”中含绿原酸不得少于0.5%。茵陈在中医临床上多以复方入药，关于茵陈饮片标准汤剂研究尚未见文献报道。本实验以茵陈饮片为对象，按照《中药饮片标准汤剂研究策略》的相关要求[4]，进行茵陈饮片标准汤剂研究，以期为茵陈饮片标准汤剂的研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1260 Infinity Ⅱ型高效液相色谱仪(G7115A型DAD检测器、G7129A型自动进样器和柱温箱、G7111A型在线真空脱气机)；FA 2204B 型万分之一电子天平(上海佑科仪器仪表有限公司)；EX225DZH十万分之一天平(美国奥豪斯仪器有限公司)；KQ5200DE 型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药

新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、1，3-二咖啡酰奎宁酸、3，4-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸对照品(成都普瑞法科技开发有限公司，批号分别为：PRF7051143、PRF7041803、15020603、PRF7061112、15042210、15062011，纯度均>98%)；对照品咖啡酸(中国食品药品检定研究院，批号：110885-200102，纯度≥98%)；色谱纯乙腈(上海麦克林生化科技有限公司)；实验用水为纯净水[华润怡宝饮料(中国)有限公司]；其他试剂均为分析纯。

本研究共收集市售15批茵陈饮片，所有饮片样品经暨南大学药学院马志国副教授鉴定为菊科植物茵陈ArtemisiacapillarisThunb.的干燥地上部分，均为“绵茵陈”。15批茵陈样品信息见表1。

表1 茵陈样品信息

2 方法与结果

2.1 茵陈饮片中绿原酸的含量测定

依照《中华人民共和国药典》2015年版一部茵陈项下含量测定方法[1]，采用Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相乙腈-0.05%磷酸溶液(10∶90)，柱温30 ℃，体积流量1.0 mL·min-1；检测波长327 nm为色谱条件测定绿原酸的含量。结果有12批样品的绿原酸含量符合《中华人民共和国药典》限量标准要求，见表2。另存在3批不合格样品。

2.2 茵陈饮片标准汤剂的制备

参考文献[4]，将12批茵陈样品制备成标准汤剂。取茵陈饮片100 g，加12倍量水，浸泡30 min，回流提取30 min，趁热过滤，药渣再加10倍量水回流提取20 min，趁热过滤，合并2次滤液，浓缩至500 mL，摇匀，得生药质量浓度为0.2 g·mL-1的茵陈饮片标准汤剂。

2.3 茵陈饮片标准汤剂中绿原酸含量测定

供试品溶液的制备：取茵陈饮片标准汤剂，摇匀，精密量取1 mL置10 mL量瓶中，加10%甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

色谱条件、对照品溶液的制备及测定方法，参考《中华人民共和国药典》2015年版一部茵陈项下含量测定方法[1]，测定12批茵陈饮片标准汤剂中绿原酸的含量，结果见表2。

2.4 转移率、出膏率计算

以绿原酸为指标成分，按公式(1)计算转移率；取茵陈饮片标准汤剂适量，摇匀，精密吸取50 mL置已恒质量的蒸发皿中，水浴蒸干，105 ℃烘3 h，取出，置干燥器中冷却30 min，称定质量，按公式(2)得出膏率。见表2。

转移率=茵陈饮片标准汤剂中指标成分质量/

饮片中指标成分质量×100%

(1)

出膏率=干膏质量/(取样量×标准汤剂生药质量浓度)×100%

(2)

表2 茵陈饮片及其标准汤剂的评价指标测定 %

2.5 茵陈饮片及其标准汤剂指纹图谱的建立

2.5.1色谱条件 采用Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)梯度洗脱(0～20 min，7%～15%B；20～30 min，15%～20%B；30～35 min，20%B；35～45 min，20%～25%B)，柱温30 ℃，流速1 mL·min-1，检测波长330 nm，进样量10 μL。

2.5.2供试品溶液制备 茵陈饮片和标准汤剂的供试品溶液分别按《中华人民共和国药典》2015年版一部茵陈项下和2.3项下方法制备。

2.5.3精密度试验 取同一批茵陈饮片标准汤剂(YC-06)的供试品溶液，按2.5.1项下条件连续进样6次，以绿原酸(3号峰) 为参照峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为<0.20%、<1.3%，表明仪器精密度良好。

2.5.4稳定性试验 取同一茵陈饮片标准汤剂(YC-06)的供试品溶液，分别于制备后 0、2、4、8、12、16 h 按2.5.1项下条件进样测定，以绿原酸为参照峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为<1.9%、<3.5%，表明茵陈饮片标准汤剂的供试品溶液在16 h内稳定性良好。

2.5.5重复性试验 平行制备6份茵陈饮片标准汤剂(YC-06)的供试品溶液，按2.5.1项下条件进样分析，以绿原酸为参照峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别<1.7%、<3.7%，表明该方法的重复性较好。

2.5.6样品检测与分析 分别取12批茵陈饮片和饮片标准汤剂供试品溶液，按2.5.1项下色谱条件测定，记录HPLC图谱。将12批饮片和标准汤剂的供试品溶液的色谱图分别导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012A版)软件，采用中位数法，时间窗宽度0.1，分别生成饮片和标准汤剂的指纹图谱(见图1)，并生成各自的对照指纹图谱(见图2)，并以对照指纹图谱为参照进行相似度评价。结果茵陈饮片指纹图谱中有7个共有峰，茵陈标准汤剂指纹图谱中有8个共有峰。12批茵陈饮片及其标准汤剂与共有模式对照指纹图谱的相似度均高于0.96(见表3)。

2.5.7成分指认 将已配制好的7种对照品溶液(绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、1，3-二咖啡酰奎宁酸、3，4-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸和咖啡酸)、茵陈饮片及其标准汤剂的供试品溶液，分别按2.5.1项下色谱条件测定，通过保留时间结合紫外光谱图对供试品溶液各色谱峰进行指认，见图2。结果茵陈饮片和标准汤剂的指纹图谱中共指认了7个共有峰，依次为新绿原酸(2号峰)、绿原酸(3号峰)、隐绿原酸(4号峰)、咖啡酸(5号峰)、1，3-二咖啡酰奎宁酸(6号峰)、3，4-二咖啡酰奎宁酸(7号峰)、4，5-二咖啡酰奎宁酸(8号峰)。1号峰未指认，通过查阅文献[5-6]，可能为1-咖啡酰奎宁酸，有待于进一步进行确认。

注：A.茵陈饮片；B.标准汤剂；2.新绿原酸；3.绿原酸；4.隐绿原酸；5.咖啡酸；6.1，3-二咖啡酰奎宁酸；7.3，4-二咖啡酰奎宁酸；8.4，5-二咖啡酰奎宁酸。图1 12批茵陈饮片及其标准汤剂指纹图谱

注：A.茵陈饮片；B.标准汤剂；2.新绿原酸；3.绿原酸；4.隐绿原酸；5.咖啡酸；6.1，3-二咖啡酰奎宁酸；7.3，4-二咖啡酰奎宁酸；8.4，5-二咖啡酰奎宁酸。图2 茵陈饮片和标准汤剂对照指纹图谱

表3 12批茵陈饮片及其标准汤剂相似度

2.5.8饮片与标准汤剂共有峰的比较 通过比较12批茵陈饮片和标准汤剂的各共有峰的平均相对峰面积(见表4)，发现饮片与标准汤剂共有峰中，除了8号峰，其他共有峰的相对峰面积差别较大。以3号峰(绿原酸)为参比峰，进一步对比两者的对照指纹图谱发现，除了8号峰，其他共有峰在标准汤剂中的相对峰高均高于饮片。

表4 12批茵陈饮片及其标准汤剂共有峰的平均相对峰面积

3 讨论

3.1 样品来源

本实验共收集了来自12个厂家的茵陈饮片15批，分别产于陕西、山东、甘肃、河南、山西5个产地。其中12批样品中的绿原酸符合《中华人民共和国药典》限量标准要求，另存在3批不合格样品，编号为YC-13、YC-14、YC-15。因此，选取合格的12批茵陈饮片为研究对象进行茵陈饮片标准汤剂的研究。

3.2 供试品前处理及色谱条件优选

在茵陈饮片标准汤剂指纹图谱供试品溶液制备方法的优选过程中，以色谱峰峰形、分离度、分析时间等为指标，对标准汤剂稀释用溶剂的种类和稀释倍数进行了考察。结果，稀释用溶剂10%甲醇优于无水乙醇；稀释10倍为最佳稀释倍数。故选取10%甲醇稀释倍数10倍为茵陈饮片标准汤剂的供试品溶液制备方法。

本实验对色谱条件进行了优选，采用乙腈-0.1%甲酸、甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液分别对流动相系统进行液相色谱分离效果的考察，结果使用乙腈-0.1%甲酸可以使色谱峰达到更好的分离效果。同时考察了不同波长(240、283、330 nm)下各活性成分的吸收情况，发现波长330 nm能兼顾大部分色谱峰的检测，最终确定2.5.1项下的色谱条件。

3.3 饮片与标准汤剂指纹图谱的比较

茵陈标准汤剂指纹图谱中含有8个共有峰，其中7个共有峰亦为茵陈饮片指纹图谱的共有峰。通过指认，这些共有峰均为有机酸类成分，且它们之间多为同分异构体。文献报道[7]，目前从植物中发现的绿原酸类异构体主要是单咖啡酰奎宁酸类(绿原酸、隐绿原酸和新绿原酸)和二咖啡酰奎宁酸类(1，3-二咖啡酰奎宁酸、3，4-二咖啡酰奎宁酸和4，5-二咖啡酰奎宁酸)；绿原酸是由咖啡酸与奎宁酸形成的酯，其分子结构中有酯键、不饱和键及多元酚3个不稳定部分，前者易发生水解，后两者易被氧化，绿原酸可通过水解和分子内酯基迁移而发生异构化；若从酯键处断裂，可产生奎宁酸和咖啡酰基的水解产物，咖啡酰基断裂后在奎宁酸上的取代位置发生重排，可产生绿原酸的同分异构体。针对茵陈饮片和汤剂两者的指纹图谱的共有峰的相对峰高差异较大这一现象，结合相关文献[8-9]，推测在煎煮过程中茵陈中的主要成分绿原酸(3号峰)和3，4-二咖啡酰奎宁酸(7号峰)可能发生了水解和异构化反应而含量降低，使得相应的异构体：新绿原酸(2号峰)、隐绿原酸(4号峰)、1，3-二咖啡酰奎宁酸(6号峰)、4，5-二咖啡酰奎宁酸(8号峰)含量增加，从而造成两者的指纹图谱出现了差异。同时，绿原酸的转移率为31.0%～62.4%，差异较大，平均转移率仅为44.5%，也可能与煎煮过程中绿原酸的水解和转化有关。因此，今后可对茵陈中有机酸类成分煎煮过程中的分解转化规律进行研究，指导其标准汤剂制备过程中工艺参数的优选。在茵陈标准汤剂质控指标方面也可增加新绿原酸、隐绿原酸等指标成分，可更好地控制质量。