食品中霉菌计数实验室内部比对的实验方法与结果分析

苏章庭 陈秀芬 曾晓琮 周 露

（广东省食品检验所 广东广州 510435）

1 前言

质量控制是指为达到质量要求所采取的作业技术和活动，目的在于监控实验过程并排除导致不合格、不满意的原因以取得准确可靠的数据和结果。采用合理有效的质量控制手段，可监控检测或校准的工作过程，预见可能出现的问题，或及时发现问题的存在，使实验室有针对性地采取纠正措施或预防措施，避免或减少不符合工作要求的问题[1]。内部质量控制是由实验室对其所承担的工作进行连续评估的所有程序组成，其主要目的是确保每个工作日检测结果的连贯性及其与特定标准的一致性。ISO17025《检测和校准实验室能力认可准则》[2]规定，实验室应有监控结果有效性的程序，其中包括实验室内比对。CNAS-CL01-A001:2018《检测和校准实验室能力认可准则在微生物检测领域的应用说明》[3]规定，在内部质量控制活动中，应给岀结果评价依据，质量控制计划应尽可能覆盖实验室的所有检测项目和所有检测人员。

在食品检测中，霉菌作为卫生指示菌，是用来评价食品生产过程霉菌污染的重要指标。霉菌属于有菌丝而没有较大子实体的小型真菌。食品中的霉菌分布广泛，种类繁多，常存在于土壤、食物和环境中，也可存在于食品加工环境、设施、工具和从业人员手部等，可通过空气以分生孢子传播。霉菌性危害不仅使食品变质腐败，还可以造成粮食类及其副产物食物中毒。由于其细胞较大，新陈代谢力强，常在102～104个即可引起食物变质，而细菌往往要比其大100倍[4]。

比对实验即是设置2个或2个以上的实验组，按照预先规定的条件就同一或类似的检测对象进行检测的组织、实施和评价。实验室应根据年度质量控制计划的需要，制定用于内部质量控制的比对实验计划。比对实验的形式包括：人员比对、方法比对、仪器比对、留样再测以及其他形式[5]。人员比对实验是指在相同的环境条件下，采用相同的检测方法、相同的检测设备和设施，由不同的检测人员对同一样品进行检测的实验。相比于其他比对实验的形式，人员比对更加侧重于考核新进人员、新培训人员的检测技术能力和监督在岗人员的检测技术能力。

本次实验参照CNAS-CL01-A001:2018《检测和校准实验室能力认可准则在微生物检测领域的应用说明》中7.7.1a的规定：“针对微生物定量检测项目，应定期使用有证标准物质/标准样品（如菌落总数标准物质、大肠菌群标准物质等）进行监控，或使用质控样品开展内部质量控制活动针对微生物定性检测项目，应定期使用标准物质/标准样品、质控样品或用标准菌种人工污染的样品开展内部质量控制。”选取霉菌计数作为人员比对的项目，依据食品安全国家标准GB 4789.15—2016《食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》[6]对质控样品进行了检验。通过了本次的人员比对，为食品微生物实验室的质量控制提供了依据，也为其他实验室的质量控制工作提供了建议和参考。

2 材料与方法

2.1 仪器、试剂与材料

2.1.1 仪器

SX-700高压灭菌锅（日本TOMY公司）；PL6001E电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；LRH-250F生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；MS3漩涡混合器（IKA仪器设备有限公司）；Masticator均质器（IUL）；智能电热恒温水浴锅（IKA仪器设备有限公司）；SW-CJ-2F超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；Milli-Q Reference超纯水机（默克化工技术有限公司）。

2.1.2 试剂

孟加拉红琼脂（北京陆桥技术股份有限公司）；磷酸盐缓冲液（广东环凯微生物科技有限公司）。

2.1.3 材料

质控样（北京美正检测技术有限公司）产品性状为白色冻干粉，规格为2支/套，产品编号MRM0120。

2.2 方法

2.2.1 人员

选取执行质量控制的实验人员A（经培训考核合格上岗，工龄2年）与B（经培训考核合格上岗，工龄3年），对该份质控样品进行检验，并按照人员比对程序对实验结果进行比对。

2.2.2 检验依据

冻干粉的水化方法按厂家配备的说明书执行，检验程序与结果报告按GB 4789.15—2016第一法执行。

2.2.3 操作步骤

（1）样品前处理

按照质控样品说明书要求，从冰箱中取出样品待其恢复到室温，准备40 mL无菌水。首先，无菌开启西林瓶，样品开启后，从40 mL无菌水中吸取2 mL注入西林瓶进行水化，待溶解后，吸出放入另一无菌瓶中，再利用余下的无菌水反复清洗西林瓶内壁，回收清洗液集中于无菌瓶中，质控样品水化后视为液体样品，即等同于40 mL的食品样品。

（2）梯度稀释

吸取25mL样品至盛有225mL无菌稀释液的无菌均质袋内，用拍击式均质器拍打1～2 min，制成10-1梯度的样品匀液。

取1 mL 10-1梯度样品匀液注入含有9 mL无菌稀释液的试管中，另在旋涡混合器上混匀，制成10-2梯度的样品匀液。

按以上操作制备10倍递增系列稀释样品匀液。本次选取100（原液）至10-5共6个梯度进行检验，每个稀释度分别吸取1 mL样品匀液注入2个无菌平皿内。同时分别吸取1 mL实验中所用稀释液加入2个无菌平皿作为空白对照。

（3）平板倾注

及时将25 mL冷却至46℃的孟加拉红琼脂倾注于加样平皿中，并转动平皿使其混合均匀。静置待培养基完全凝固。琼脂凝固后，正置平板置于（28±1）℃培养箱中进行培养，培养过程中随时观察检测结果并记录，最终记录培养至第5 d的结果。

3 结果

由检验人员对各自的霉菌总数进行计数，计数方法参照GB 4789.2—2016《食品微生物检验 菌落总数测定》[7]的相应规定进行计算，结果详见表1。

表1 人员比对测定结果

测定结果参考SN/T 1800—2006《食品和动物饲料微生物学30℃菌落计数方法》[8]，根据结果复现性的计数要求，对测定结果取以10为底的每毫升中微生物计数的对数，不同操作者检验结果之间的绝对差值不大于复现性限R=0.45。结果在指定值±0.45范围内判定为满意，反之为不满意。产品分析证书提供的霉菌计数的特征值为7 CFU/mL，特性区间为2～22 CFU/mL，检验结果在特性区间内即为满意。结果详见表2。

表2 结果的数据处理

由表2可知，本次人员比对2名人员的检验结果均在特性区间内，复现性0.13小于复现性限R=0.45，结果为满意。

4 讨论

内部质量管理是每个实验室必须进行的质量管理活动，人员比对是评价实验室内部质量管理的有效方法之一。食品检验机构应当对检验活动实施内部质量控制和质量监督，有计划地进行内部审核和管理评审，采取纠正和预防等措施持续改进管理体系，不断提升检验能力，并保存质量管理记录[9]。在质量管理中，实施内部质量控制有利于实验室质量状态的确认。对于某些不满意的结果，实验室可以深入分析，及时发现原因，从而采取相应的纠正措施，提高实验室质量。另一方面，通过这一类的质量控制活动，考核检验人员的技术水平，树立良好的质量意识，提高人员的素质能力。组织比对活动可以进一步提升个人与实验室的能力[10]。

比对实验能力评价方法包括但不限于利用标准物质或标准样品特征值、利用方法的重复性限、F检验和t检验、En值、Z值等方法。综合现有的国内外标准，不同方法的重复性r不同，相同检测项目的不同食品基质、不同检测培养基或不同菌落本底的重复性限可能不同[11]。在对于霉菌检测的质量控制中，ISO 6611—2004《乳和乳制品 酵母和（或）霉菌菌落形成单元的菌落计数 25℃时的菌落计数技术》[12]也规定了重复性要求，即重复实验条件下所获得的2个独立单一检测结果的绝对差值，较高结果比较低结果高30%的情况不到5%。

影响检测工作准确性的因素有很多，要真正提高实验室的检测能力，除了要践行内部质量控制，更要积极参与各类外部实验室间的质量控制。只有这样才能了解检验员检验能力的真实水平，从而发现问题，采取措施，进而有针对性地改进工作，达到持续提升的目的。