气相串联质谱法测定薄荷香精中二氢香豆素

林伟斌，谭丽容，程 敏，张龙开

(弘正道(中国)中药研究有限公司，广东 广州 510665)

香豆素类化合物是存在于芸香科、伞形科、菊科、豆科、瑞香科、茄科等高等植物和动物及微生物代谢产物中的一类天然香料，在药物及化妆品、清洁剂、除臭剂等日化产品的生产中常被用作香料从而广泛使用[1]。为增加香气或掩盖不良气味，生产企业通常会在日化产品中添加一定量的日用香精[2]，而日用香精的安全性与日化产品的安全性息息相关。据研究报道，较高浓度的香豆素类化合物在接触皮肤后，可引起过敏反应；此外，口服摄入可对人体肝脏产生损伤[3-4]。

鉴于香豆素类化合物对人体健康的危害性，加拿大卫生局(Health Canada)将二氢香豆素列为禁用日化添加剂[5]。欧盟化妆品法规Regulation(EC)1223/2009[6]、我国《化妆品安全技术规范》(2015年版)[7]、GB 22115-2008《牙膏用原料规范》[8]、GB/T 22731-2017《日用香精》[9]均明确禁止在化妆品或日化原料中加入二氢香豆素。食用香精，如薄荷香精，虽多以食品添加剂广泛应用于各类食品中，但也常被添加到牙膏产品中[10]，故对其中禁用致敏成分二氢香豆素的监控具有一定的意义。

目前，关于香豆素类化合物的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)[11-14]、气相色谱法(GC)[15]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[4,16-17]、气相色谱-质谱法(GM-MS)[18-19]，但尚未见有使用气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)测定二氢香豆素的文献报道。本研究建立了薄荷香精中二氢香豆素的气相色谱-三重四级杆串联质谱快速测定方法，既可以准确定量，亦可以定性，避免了假阳性结果的发生，方法准确、快速、简便、无污染，为香精行业提供质控方法参考。

1 实 验

1.1 仪器与试剂

Thermo TSQ 8000 EVO型气相色谱-串联质谱仪(配有EI源)，美国Thermo Fisher公司；TOLEDO电子天平，瑞士Mettler公司；ST16R离心机，美国Thermo Fisher公司；88880018型涡旋混合器，美国Thermo Fisher公司。

二氢香豆素(CAS号：119-84-6，纯度≥99.0%)，上海安谱实验科技股份有限公司；无水乙醇(色谱纯)，德国Merk公司；无水硫酸钠(分析纯)，广州化学试剂厂；市售薄荷香精，溶剂均为丙二醇。

1.2 标准储备液及标准工作液的制备

称取二氢香豆素标准品0.1 g(精确至0.1 mg)置于100 mL容量瓶中，用无水乙醇溶解并定容至刻度，配制成质量浓度为1.0 mg/mL的标准储备液。使用时以无水乙醇逐级稀释成适宜浓度的混合标准溶液，均于4 ℃避光保存。

1.3 样品处理

准确称取薄荷香精0.2 g(精确到0.1 mg)，置于50 mL离心管中，精密加入10 mL无水乙醇，涡旋5 min，加入0.5 g无水硫酸钠，涡旋3 min，4000 r/min离心5 min，上清液经0.22 μm 滤膜过滤后供GC-MS/MS测定。

1.4 色谱条件

色谱柱：TG-1701MS石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气：高纯氦气，纯度>99.999%；流速：1.0 mL/min；进样口温度：250 ℃；进样体积：1 μL；，进样方式：不分流进样，1 min后打开分流，分流比为50:1；升温程序：初始温度70 ℃保持1min，以5 ℃/min速率升至140 ℃，再以30 ℃/min速率升至280 ℃，保持10 min。二氢香豆素的色谱图见图1。

图1 二氢香豆素的色谱图

1.5 质谱条件

表1 二氢香豆素的质谱分析参数

*定量离子对。

电子轰击离子源(EI)，电离能量70 eV，接口温度280 ℃，离子源温度230 ℃，13 min溶剂延迟，采用多反应监测模式(SRM)进行离子检测，二氢香豆素的监测离子对、碰撞能量见表1，带*的子离子与其对应的母离子为定量离子对。质谱图见图2。

图2 二氢香豆素的质谱图

2 结果与讨论

2.1 样品处理方式的选择

为了简化前处理步骤并尽可能获得好的提取效果，本研究采用涡旋震荡的方式对样品中二氢香豆素进行提取，分别考察了无水乙醇、二氯甲烷、正己烷、四氢呋喃等不同提取溶剂的提取效果。结果表明：无水乙醇、二氯甲烷和四氢呋喃均与香精的原有溶剂混溶度较好，可将目标物提取完全，而正己烷则与香精混合后出现分层现象，综合考虑经济性及安全性，选择毒性小、在气质上无干扰的无水乙醇为提取溶剂。此外，香精样品中大多含有水、乙醇、丙二醇和丙三醇[19]，样品中的水分对毛细管色谱柱和GC-MS/MS检测器有较大的损害，故需要以无水硫酸钠作为干燥剂，除去样品溶液中的水分。

2.2 色谱柱的选择

本研究在相同试验条件下考察了TG-5MS，TG-1701MS，TG-WaxMS等不同极性色谱柱的分离效果，结果表明：二氢香豆素在三种色谱柱上分离效果均较好，色谱峰响应值较高，峰形尖锐，对称性好，如图3所示。但TG-WaxMS属于强极性柱，最高使用温度较低(250 ℃)，其固定液易流失，会对GC-MS/MS系统造成污染。另外，TG-5MS在分析香精样品时存在干扰峰，故选择TG-1701MS(最高使用温度280 ℃)作为分析柱。

图3 不同色谱柱分离得到的色谱图

2.3 方法的线性范围和检出限、定量限

将二氢香豆素标准储备液用无水乙醇稀释成浓度分别为0.1 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL的标准工作溶液，在确定的色谱及质谱条件下进行测定，以二氢香豆素的质量浓度为横坐标X，以定量离子响应峰面积为纵坐标Y，拟合标准曲线得到线性回归方程和相关系数。结果表明，二氢香豆素在0.0001～0.0100 mg/mL质量浓度范围内拟合线性良好，相关系数为0.9995。

在空白样品中添加低浓度目标物，按“1.3”所述样品处理方法进行样品前处理，上机检测，以至少3倍和10倍信噪比(S/N)对应的浓度计算检出限和定量限。二氢香豆素的方法检出限(limits of detection, LOD)为0.5 mg/kg，定量限(limits of quantitation, LOQ)为1.5 mg/kg。二氢香豆素的线性方程、相关系数、线性范围、检出限以及定量限结果见表2。

表2 二氢香豆素的线性方程、相关系数、线性范围、检出限以及定量限

2.4 回收率与精密度

在空白基质样品中加入二氢香豆素标准溶液，加标量分别为1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、4.0 μg/mL，经GC-MS/MS分析后，根据加标量和测定值计算方法回收率。精密度实验采用对相同标准品不同质控浓度，同等条件下重复分析6次，以相对标准偏差(relative standard deviation, RSDs)表示方法精密度，结果见表3。

表3 方法回收率与精密度(n=6)

由表3可知，添加量为1.0 μg/mL时，回收率在105%～117%之间，RSD为4.1%；添加量为2.0 μg/mL时，回收率在109%～117%之间，RSD为3.8%；添加量为4.0 μg/mL时，回收率在110%～117%之间，RSD为3.6%，表明本方法的准确度和精密度良好。

2.5 实际样品测定

应用所建立的GC-MS/MS方法对薄荷香精样品中二氢香豆素进行分析检测，结果显示，所检测的不同公司、不同批次的6个薄荷香精样品中均未检出二氢香豆素。

3 结 论

本研究建立了气相色谱-三重四级杆串联质谱法测定薄荷香精中二氢香豆素的检测方法。该方法具有良好的线性、精密度和准确度，为快速、准确测定薄荷香精中的二氢香豆素提供了技术参考。