内皮素1基因rs5370位点多态性与中国女子长跑运动员运动表现之间的关联性研究

杨贤罡1， 李燕春 邓潇潇3 胡扬

1 河北省体育科学研究所河北省神经肌肉功能与力量训练实验室（河北石家庄050011）

2 北京体育大学中国运动与健康研究院（北京100084）

3 重庆第二师范学院教师教育学院（重庆400065）

心血管系统的良好适应性是评估优秀长跑运动员的首要因素[1]。内皮素-1（endothelin-1，ET-1）是人体内作用最强的内源性血管收缩肽[2]，参与运动中血管、呼吸道平滑肌的增生[3]，参与运动员心脏的重塑[1]和低氧习服过程[4，5]，是评估长跑运动能力适宜的候选基因。

人类内皮素-1基因（Endothelin 1，EDN1）位于染色体6p24.1，全长6836bp，包括5个外显子和4个内含子，含有2156个SNP位点。EDN1基因转录的mRNA首先翻译合成前内皮素原（preproendothelin-1，ppET-1），随后ppET-1经特异内肽酶进行第一次酶切产生内皮素原（preendothelin-1，pET-1），pET-1在运动等应激情况下经内皮素转换酶进行第二次酶切产生成熟的ET-1[2]。rs5370位点位于第5外显子的第61个核苷酸，发生G→T的突变，导致第198个密码子发生赖氨酸→天门冬氨酸的转变。该位点的表示方式包括Lys198Asn，G198T，G5665T和K198N 等。rs5370位点的多态性与高血压及相关疾病[6]以及ET-1水平[7，8]相关联。本实验室前期提出其GT基因型可以作为优秀北方汉族长跑运动员选材和北方汉族男性心功能训练效果的标记[9]。高原训练是长跑运动员重要的训练内容，rs5370位点多态性同样与高原的适应能力[7]和HiHiLo训练的敏感性[9]存在联系。

由于前期针对运动员群体rs5370位点的研究仅采用case-control设计，缺乏与运动能力表型，特别是竞技成绩的关联性研究，且该位点的分布及对表型的影响存在性别差异[9，10]。因此，本研究选取备战2012年伦敦奥运会周期内的中国女子长跑运动员作为研究对象，分析该位点在我国女子长跑运动员中的分布频率及特征；通过rs5370位点与肺功能、运动生理机能和竞技成绩之间的横向关联性分析，为深入阐述rs5370位点的多态性与长跑运动能力之间的关系及将其应用于运动员选材工作提供依据。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

于2009年3月至2010年5月期间选取中国女子专业长跑运动员共79名，包括1名回族，其余均为汉族，出生地包括以辽宁、山东、河南为主的北方省份（n=64，82.1%）和以贵州、云南、江苏等为主的南方省份（n=14，17.9%），主项包括5000 米、10000 米和马拉松，绝大多数运动员存在兼项情况。该运动员样本占中国田径协会运动员实时注册数据库的近80%，其中健将级以上运动员达到90% 以上。

运动员基本情况：年龄22.33 ± 2.50岁，身高164.76 ± 5.08 cm，体重52.10 ± 7.20 kg，训练年限4.99 ± 2.62年，其中国际健将19名，健将13名，一、二级水平47名。所有受试者均知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 血样采集及全基因组DNA提取

使用EDTA.K2 抗凝管收集运动员静脉血5 ml。用Promaga公司基因组DNA提取试剂盒提取白细胞中的全基因组DNA，分装于-70摄氏度保存待测。

1.2.2 基因多态性分析

DNA 样本经稀释（至5 ng/mL）后进行PCR扩增，扩增后经碱性磷酸酶消化处理后，再进行单碱基延伸反应，对终止反应物进行脱盐和悬浮后，将最终分型产物点样到芯片上，并用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术（MALDI-TOF）进行分析。SNP位点分型利用美国Sequenom公司的MassARRAY 系统完成，PCR引物和单碱基延伸引物用Assay Designer软件包设计，基因型解析由上海邃志生物科技有限公司完成。随机选取5名运动员的样本采用基因测序以验证MALDITOF 检测结果，基因测序由上海生物工程有限公司完成。

rs5370位点的PCR 引物和单碱基延伸引物如下：PCR 引物1：ACGTTGGATGGGTCTGTCACCAATGTGCTC，PCR引物2：ACGTTGGATGCTTTTCATGATCCCAAGCTG。产物长度为100个碱基对，退火温度为 53.7℃。延伸引物为 GATCCCAAGCTGAAAGGCAA（分子量为6144）。

不同等位基因的PCR 延伸产物及分子量如下：等位基因为G 时延伸产物为GATCCCAAGCTGAAAGGCAAG（分子量6431.2）；等位基因为T时延伸产物为GATCCCAAGCTGAAAGGCAAT（分子量6471.1）。

1.2.3 生理机能测试

采用日本CHESTGRAPH HI-101型肺功能仪测试运动员的肺活量（vital capacity，VC）、用力肺活量（forced vital capacity，FVC）、1 秒用力呼气量（forced expiratory volume，FEV1）、每分通气量（minute ventilation volume，MVV），并计算FEV1/FVC%。

采用逐级递增负荷跑台方案测试无氧阈摄氧量（VO2-AT）、无氧阈速度（V-AT）、最大摄氧量（VO2max）、最大跑速（V-VO2max）和最大通气量（VE），并计算VO2-AT/ VO2max。测试方案、测试仪器和跑速判断标准等见文献[11]，力竭、通气无氧阈的判断标准见文献[12]。

测试时间为2009年3月至2010年5月，期间运动员均处于专项有氧能力储备阶段，无明显伤病和疲劳情况。

1.2.4 个人最好成绩（personal best，PB）

通过国际田联和中国田径协会官方网站的赛事成绩查询系统检索运动员3个主项的PB，部分赛事数据不全者采用对教练员进行回访追溯的方式获取。

进行横向关联分析所采用的PB 数据包括运动员接受生理机能测试时的PB（记做PB1）和截止到2018年11月时的PB（记做PB2）两部分。PB2获取时所有运动员均已退役，其中国际健将和国家健将分别达到了25名和21名。

1.2.5 统计学分析

采用χ2检验进行哈温平衡分析，比较不同样本间基因型、等位基因频率分布的差异，以及不同基因型携带者运动水平分布的差异，并计算OR值及95%CI。不同基因型携带者之间生理表型指标的比较先通过斜率同质性检验排除训练年限和基因型之间的交互作用，再以训练年限作为协变量进行协方差分析，最后通过LSD法进行事后两两比较。不同基因型间个人最好成绩的比较通过单因素方差分析进行，并通过LSD 法进行两两比较，显著性水平定为P＜0.05。

2 结果

2.1 EDN1基因rs5370位点的基因型解析结果

rs5370位点的检测成功率100%，随机选取的运动员样本经基因测序与MALDI-TOF结果完全吻合。

2.2 中国女子长跑运动员EDN1基因rs5370位点的基因型频率和等位基因频率分布

中国女子长跑运动员的rs5370位点中，GG、GT和TT基因型的频率分别为50.6%、36.7%和12.7%。等位基因G和T频率分别为69.0%和31.0%。

提取相近人群研究中的样本来源、例数、基因型和等位基因频率等数据（表1），需要考虑到不同样本之间在区域、种族和性别等方面的异质性。在普通健康人群中，样本9～12 不符合哈温平衡定律，不具有群体代表性。运动员人群中，样本1 同样不符合哈温平衡定律。

剔除普通健康人群的样本9～12后，将中国女子长跑运动员与其他人群样本进行比较，结果发现，基因型频率分布与普通健康人群样本1～3（χ2=8.08，P=0.02；χ2=61.10，P=0.00；χ2=21.84，P=0.00），运动员人群样本1、2 之间均具有显著性差异（χ2=6.75，P=0.03；χ2=7.44，P=0.02）；等位基因频率分布与普通健康人群2、3 之间存在显著性差异（χ2=70.32，P=0.00；χ2=21.69，P=0.00），与运动员人群样本无显著差异。

2.3 EDN1基因rs5370位点不同基因型携带者之间生理表型指标比较

训练年限和rs5370位点多态性对所有肺功能指标的影响均无交互作用。以训练年限作为协变量进行协方差分析，结果显示rs5370位点多态性对肺功能指标均无显著影响，见表2。

表2 rs5370多态性位点不同基因型携带者之间肺功能指标比较

训练年限和rs5370位点多态性对所有运动机能指标的影响均无交互作用。以训练年限作为协变量进行协方差分析，结果显示rs5370位点多态性对VO2max和VO2-AT/VO2max 均存在显著影响（P=0.002，P=0.040）。事后两两比较结果发现，GT基因型携带者的VO2max 显著高于GG 基因型携带者（P=0.000），而对于VO2-AT/VO2max，前者显著低于后者（P=0.019），详见表3。

表3 rs5370多态性位点不同基因型之间生理机能指标比较

2.4 EDN1基因rs5370位点不同基因型携带者竞技成绩和运动等级分布比较

本研究中运动员群体3个单项的PB2较PB1均有显著提高（5000 米：P=0.017；10000 米：P=0.011；马拉松：P=0.002），见表4。

rs5370位点多态性对10000米的PB2存在影响趋势（P=0.076），两两比较发现GT基因型携带者的10000米PB2显著快于GG基因型携带者（P=0.024），见表5。

表4 运动员2010年和2018年各单项PB的比较

表5 rs5370多态性位点不同基因型携带者之间各单项PB2的比较

不同基因型携带者的运动水平分布情况见表6。将国家健将和一、二级合并为国家水平，发现GT基因型携带者在国际健将和国家水平上的分布存在显著差异（χ2=6.19，P=0.013），GT基因型携带者成为国际健将的OR值=3.73（95%CI：1.29～10.81）。

表6 rs5370多态性位点不同基因型携带者运动等级分布

3 讨论

3.1 选择EDN1基因rs5370位点作为长跑运动表现候选基因标记的依据

规律性运动能够降低动物心肌中ET-1的mRNA表达[19]，以及人体血浆中的ET-1水平[20，21]，ET-1所介导的血管收缩力下降是有氧运动介导内皮依赖性血管扩张功能改善的重要机制[22]。运动减弱冠状血管的收缩通过减少ET-1的产生所介导[23]，且ET-1能够反映运动诱发心肌缺血的严重程度[24]。但中长跑运动员ET-1的基础水平和急性运动后的增加幅度更高[25]，则与耐力训练引起心血管系统内分泌的适应性改变有关。除心血管外，ET-1 同样促进呼吸道平滑肌的收缩和增生。哮喘患者[26]和青年足球运动员[27]在剧烈运动后，发生运动性支气管痉挛者的呼出气冷凝液和血浆中的ET-1均显著升高，而对照组不变或下降。运动后血浆ET-1 升高的幅度与VO2max 呈正相关，提示ET-1 增强心血管的收缩与运动员良好的心肺功能有关[25]。此外，ET-1还可以用于高原或低氧习服程度的评估。大学生游泳运动员高原训练中晨起血清ET-1的变化率与高原训练前后专项成绩的变化率呈负相关，血清ET-1下降提示低氧习服快[4]。但是在北方汉族大学生中，习服者在低氧训练后再次接受低氧暴露后的ET-1水平和升高程度均高于未习服者[5]。

rs5370位点的T等位基因或TT基因型与更高的血压基础水平[28]、面对应激时更大的血压反应[29]和更强的血管收缩[30]相关联。rs5370位点的多态性与心功能、心肺耐力的基础水平[9]，以及血压[28]、心功能、心肺耐力[9]的训练适应性相关联，不同研究结果之间的差异可能与研究对象的群体代表性、训练背景[9]和种族[28]有关。

上述研究基础提示EDN1基因rs5370位点是评估长跑运动能力适宜的候选基因标记。

3.2 EDN1基因rs5370位点多态性与长跑运动能力的关联性及机制探讨

本实验室前期通过case-control设计发现北方汉族优秀长跑运动员（健将和国际健将）中，GT基因型的分布频率显著高于普通人[9]。由于本研究的运动员样本包含部分非健将级运动员，整体水平低于前期的运动员样本。比较这两份运动员样本的结果，发现基因型频率存在显著差异，同样表现为GT型频率前期样本高于本研究样本，分别为0.59和0.37。与此同时，与北方汉族优秀男子长跑运动员进行比较，发现基因型频率同样存在差异，这种差异可能涉及性别因素[10]。在北方汉族的普通人和优秀长跑运动员中，均表现出TT基因型和T等位基因的频率女性高于男性[9]。

EDN1基因rs5370位点的多态性对肺功能存在影响。携带TT型的阻塞性睡眠呼吸暂停患者，其呼吸暂停低通气指数显著高于GG、GT携带者[10]。慢性阻塞性肺病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）患者中，GT基因型携带者FEV1每年的下降程度低于GG基因型携带者[31]。但本研究在中国女子长跑运动员中未发现不同基因型携带者之间的肺功能指标存在差异，推测原因与rs5370位点多态性对运动员人群肺功能的影响很小，并被环境因素（如训练经历）所遮掩有关。

EDN1基因rs5370位点的多态性同样影响有氧运动能力，COPD 患者中rs5370位点GG 型携带者的VO2max水平更高（OR=6.1，95%CI=0.83～11.4）[32]。本研究结果显示：中国女子长跑运动员中rs5370位点的多态性与运动生理学指标显著关联，GT基因型携带者的VO2max和10000米PB显著优于GG型携带者。推测其原因在于：（1）升高ET-1 水平增强心血管系统机能。rs5370多态性会影响ET-1的生成水平，TT型携带者的血浆ET-1水平显著高于GT和TT型携带者[7，8]。此外，高原训练约占长跑运动员总训练时间的1/6～1/4。ET-1可通过HIF-1α诱导来促进血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）基因的表达[3]，VEGF的生成增加改善肌肉的氧交换。（2）提高Ca2+的敏感性改善跑步经济性（running economy，RE）。T 等位基因与Ca2+介导的血管收缩力量增加相关联[30]。竞技长跑项目对RE 水平要求很高，Ca2+的敏感性增加可以降低肌纤维收缩和神经-肌肉传导过程对Ca2+的需要，减少Ca2+泵的能量消耗，有助于提高长跑运动员的RE水平[33]。（3）促进糖酵解代谢途径。蛋白质中特定的赖氨酸残基与糖酵解中间代谢产物发生反应，该反应抑制糖酵解酶的活性[34]。rs5370位点导致的非同义突变解除了这一反应对糖酵解酶活性的抑制，有利于增强长跑运动员在比赛中的加速和冲刺能力，以获得更好的PB。上述改变有利于提高有氧运动能力和竞技成绩。由于rs5370位点所在区域在第一次酶切过程中被剪切，因此推测该位点的突变主要是通过影响mRNA的稳定性、改变ppET-1的氨基酸序列甚至空间结构以及第一次酶切过程影响成熟ET-1的生成，而对第二次的酶切过程影响不大，需要进一步研究证实rs5370多态性位点的生物学功能。本研究并未观察到TT携带者高于GT、GG携带者，原因可能与过高水平的ET-1导致血管收缩增加和血压升高，反射性抑制了心率[25]，降低了运动中心脏泵血功能的储备能力，产生了不利结果[1]。同时TT型携带者的例数较少可能导致结果偏倚。

但是GT型携带者的VO2-AT/VO2max显著低于GG携带者。AT与VO2max、RE是长跑运动员取得成功的3个关键生理学因素，VO2-AT/VO2max 是AT 摄氧量与VO2max 之间的比值。国际优秀女子长跑运动员的VO2-AT/VO2max 为80%～90%左右，该值越大，说明相对于遗传基础，有氧训练的水平越高[12]，一定程度上可以反映运动员在AT 时的RE 水平[35]。由于AT 相比较VO2max受训练因素的影响更大，长时间耐力性训练可使肌肉工作效率和RE每年提高1%～3%[35]，因此推测该结果可能与训练年限有关。

鉴于运动表现受多基因调控的复杂性，rs5370位点对运动表型的影响还受到不同基因相互之间、同基因不同位点之间的连锁不平衡以及社会环境因素的影响。ET-1介导平滑肌的收缩与肾上腺素系统[36]、NO[27]、环前列腺素[37]、血管紧张素II[30]等激素或信号分子之间存在交互作用。rs5370和rs4714383 所构建的单体型对HERITAGE人群收缩压、脉压差训练适应性个体差异的解释程度分别为2.6%和3.5%，其中单一位点的解释程度为0.8%～1.7%[28]。rs5370位点的多态性对血压、心肺功能等表型指标的影响与肥胖[10]、心肺耐力[28]、社会经济状况[29]等因素存在交互作用。

4 结论

本研究通过横向关联研究设计分析了在中国女子长跑运动员中，EDN1基因rs5370位点多态性与运动生理机能和竞技成绩之间的关系，并通过与本实验室前期北方汉族优秀运动员样本的对照分析，进一步证实了rs5370位点GT基因型是中国女子长跑运动员的敏感基因标记，且GT 型携带者的有氧运动能力和10000米PB更好。