五种寒地果树果实的多酚含量、抗氧化活性及抗α淀粉酶活性分析

刘 佩,谢佳璇,秦 栋,刘化禹,马小雯,张 妍,霍俊伟

(1.东北农业大学寒地小浆果开发利用国家地方联合工程研究中心,黑龙江哈尔滨 150030;2.东北农业大学园艺园林学院,黑龙江哈尔滨 150030)

近年来,由于慢性病发病率和死亡率的不断上升,以及临床口服药物潜在的副作用,将植物中的生物活性物质作为天然产物来预防和辅助治疗慢性疾病,受到了人们的广泛关注[1]。

多酚作为果实中重要的次生代谢物质[2],被称为“第七类营养素”[3],具有多种生理活性作用。如葡萄、李子中的酚类物质对肥胖诱导的血脂异常等代谢紊乱的病症有较好的预防作用,还可抗血小板凝结、调节雌激素等[4-5]。花青素是多酚类物质的重要组成部分[6]。据报道[7],富含花青素的水果如桑葚、蓝莓等,均对癌症、肿瘤和心脑血管疾病有预防作用[8],具有降血糖、抗氧化的生理活性,还可提高生物体免疫力[9]。抗氧化活性是抗癌、抗衰老等生物功能的基础,研究果实抗氧化活性对人们的健康有重要意义[10]。果实的抗氧化性主要是由果实的酚类物质抑制氧化的表现[11]。蔓越莓中黄酮醇类对DPPH自由基的清除能力较强[12]。Duan等[13]提出黑枸杞中的花青素可有效地增加自由基的清除率。

α-淀粉酶抑制剂通过抑制α-淀粉酶的活性,使糖尿病患者的血糖降到理想状态[14]。目前报道的天然植物降糖药物已有数百种[15],它们可避免口服药物(如阿卡波糖、伏格列波糖等)对人体的副作用[16]。王周在45种果蔬中发现猕猴桃、芹菜提取物对α-淀粉酶的抑制活性最强[17]。Liu等[18]的研究表明,葡萄籽的阿卡波糖当量值(5710 μmol AE/g)是阿卡波糖(1550 μmol AE/g)的4倍,具有优于阿卡波糖的抗α-淀粉酶活性。此外,研究发现一些植物生理活性物质,如黄酮类、多糖和生物碱等,也可以抑制α-淀粉酶活性,达到降低血糖的效果[19]。如枸杞多糖、黄芪多糖、龙眼皮的原花青素都能显著抑制α-淀粉酶[20-21]。

寒地果树果实富含糖酸、矿质元素、氨基酸以及多种酚类物质,在预防慢性疾病和维持人体健康方面有较好的作用[3,22]。Kähkönen等[23]研究发现,黑穗醋栗和欧洲越橘果实的总酚含量显著高于苹果。周劭桓等[24]的研究表明,欧洲越橘、黑加仑、红豆越橘、红树莓、花揪等果实含有大量多酚,具有很好的抗氧化性。软枣猕猴桃、黑果腺肋花楸、草原樱桃、白穗醋栗、蔓越莓作为优良的寒地特色果树[25],对其次生代谢物质以及生理活性的研究较少。因此，本试验对软枣猕猴桃、黑果腺肋花楸、草原樱桃、白穗醋栗、蔓越莓五种果树的总酚含量、总花色苷含量、抗氧化活性及抗α-淀粉酶活性进行测定及比较和评价,以期为寒地果树资源的进一步开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

白穗醋栗、软枣猕猴桃、草原樱桃、黑果腺肋花楸和蔓越莓果实 均采自东北农业大学的寒地小浆果种质资源圃，于2018年6～9月采摘结果枝条中部完全成熟的果实。玉米淀粉、福林酚(Folin-Ciocalteu)试剂、没食子酸标品 纯度99%,上海源叶生物科技有限公司;Trolox(6-羟基-2,5,7,8-四甲基氯代甲烷-2-羧酸)、DPPH(2,2-二苯基-1-苦基肼)、荧光素钠、ABTS(2,2′-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐)、AAPH(2,2′-偶氮二(2-甲基丙脒)二盐酸盐)、FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O、TPTZ(2,4,6-三三嗪基-s-三嗪) 北京博奥拓达科技有限公司;阿卡波糖、α-淀粉酶 Sigma公司。

帝肯infinite M200酶标仪 上海道尚生物科技有限公司;赛默飞世尔LL30000冻干机 深圳市华德维康科技有限公司;TGL-20bR高速冷冻离心机 广州沪瑞明仪器有限公司;柯祁UV1700紫外-可见分光光度计 上海元析仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 果实预处理 将采集到的果实,用冻干机冻干后研磨成粉,于-20 ℃保存;取10 g果实冻干粉,按照1∶10的料液比加入浓度为80%的甲醇,于摇床中200 r/min室温振荡2 h,4 ℃离心(8000 r/min,10 min),取上清,得到多酚提取液,用于本试验所有指标的测定。

1.2.2 总酚的测定 使用Folin-Ciocalteu法[26]测定果实的总酚含量(TPC)。构建没食子酸的校准曲线(y=5.3815x+0.0003,R2=0.9991)。果实的TPC表示为每100 g干重果实的没食子酸(GAE)当量(mg)。

1.2.3 总花色苷的测定 根据pH示差法[27]分别测量果实的总花色苷含量(TAC)。借助方程式(1)(2)计算果实的TAC。结果表示为每100 g干重果实的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(C3G)当量(mg)。

A=(A510 nm-A700 nm)pH1.0-(A510 nm-A700 nm)pH4.5

式(1)

式(2)

其中:A为吸光度;MW为C3G的分子量(449.2);DF为稀释倍数;ε为摩尔吸光系数(26900)。

1.2.4 果实提取物的抗氧化能力

1.2.4.1 DPPH测定 参考Brand-Williams[28]的方法测定。用0.1～0.8 mmol/L的Trolox绘制校准曲线(y=0.1608x-10.928,R2=0.9969),样品的抗氧化能力表示为每g干重果实的Trolox当量(μmoL),下同。

1.2.4.2 ABTS测定 参考Roberta等[29]的方法测定。用0.05～0.5 mmol/L的Trolox绘制校准曲线(y=0.718x+0.6676,R2=0.9994)。

1.2.4.3 FRAP测定 参考Nayak等[30]的方法,略作修改。将FRAP试剂(150 μL)加热至37 ℃后与10 μL稀释的样品以及30 μL去离子水快速混合,并在593 nm处测定反应30 min时的吸光值。使用浓度0.1～1.0 mmol/L的FeSO4·7H2O制备的标准曲线(y=0.0003x+0.0186,R2=0.9922)。

1.2.4.4 ORAC测定 参考Huang等[31]的方法,并加以改动。将20 μL稀释的样品或Trolox与160 μL荧光素溶液(8.16×10-5mmol/L)混合在96孔板中,再加入20 μL的AIBI溶液(153 mmol/L)以淬灭荧光。在37 ℃下测量2 h内每分钟的荧光。用0.01～0.2 mmol/L的Trolox制作标准曲线(y=0.0249x+24.717,R2=0.9946)。

1.2.5 果实提取物对α-淀粉酶的抑制活性 参考Liu等[18]的高通量淀粉浊度法,以阿卡波糖作为阳性对照,将0.5 g玉米淀粉溶解在磷酸缓冲液(0.1 mol/L,pH=6.9)中,然后在400 ℃下搅拌2.5 min左右至半透明状。将20 μL稀释的样品或阿卡波糖或PBS溶液(作为对照)与20 μL 0.2 mg/mL的猪胰α-淀粉酶于96孔板中充分混合后,加入60 μL糊化的玉米淀粉溶液,并在660 nm下读取2 h内混合物的吸光度,绘图,得到不同果实对α-淀粉酶活性抑制的动力学曲线。

式中:AUC样为抑制曲线下的面积和AUC对照表示对照曲线下面积,IC50为可定义为在产生50%酶活性抑制的抑制剂浓度。

1.3 数据处理

采用SPSS 21.0进行ANOVA方差分析及Person相关性分析。所有试验均重复3次,数据结果表示为“平均值±SD”。

2 结果与分析

2.1 不同果实的总酚、总花色苷含量及比较分析

不同果实中的总酚和总花色苷含量差别较大,见表1。黑果腺肋花楸的总酚和总花色苷含量均显著高于白穗醋栗、草原樱桃、软枣猕猴桃和蔓越莓(P<0.05),分别为66.43 mg GAE/100 g和46.45 mg C3G/100 g,约为它们的1.4～5倍;草原樱桃总酚含量、总花色苷含量均较高,为27.43 GAE/100 g和17.56 mg C3G/100 g。Hakkionen等[32]对比了多种植物的总酚含量,结果表明黑果腺肋花楸的总酚含量最高。有关研究显示,花青素及其糖苷类化合物为黑果腺肋花楸果实中单体多酚的主要组分(56.7%～75.2%)[33],这与本文研究结果一致。可见,黑果腺肋花楸具有丰富的酚类物质。同时,白穗醋栗中的总酚含量(46.21 mg GAE/100 g)仅次于黑果腺肋花楸,但总花色苷含量却是五种树种中最低的,仅为0.15 mg CSG/100 g。据Contessa等[34]报道,在与黑莓、草莓和软枣猕猴桃等17种水果比较中,白穗醋栗表现出高的总酚含量(362.15 mg GAE/100 g),低的花色苷含量(0.93 mg C3G/100 g),这也与本文研究结果一致。结合植物形态学可知,白穗醋栗成熟果实的果皮果皮颜色较浅,因此其花色苷含量较低。Määttä等[35]的研究指出其酚类含量较高可能是由于羟基肉桂酸衍生物(咖啡酸己糖衍生物、对香豆素酸4-O-葡萄糖苷、己糖、阿魏酸己糖和阿魏酸己糖衍生物)和黄酮醇苷类(芦丁、槲皮素3-O-葡萄糖)所致,同时还发现原花青素和酚酸才是白穗醋栗中主要的酚类化合物。

表1 5种果实提取物的总酚含量(TPC)、总花色苷含量(TAC)(n=3)Table 1 Total phenolic content and total anthocyanin content of methanol extracts from five fruits

2.2 不同果实的抗氧化活性分析

不同果实的抗氧化活性有所不同,结果见表2。果实多酚对DPPH·和ABTS+·的清除能力由强至弱依次为:白穗醋栗>黑果腺肋花楸>草原樱桃>蔓越莓>软枣猕猴桃;白穗醋栗果实多酚对DPPH·、ABTS+·能力最强,分别为414.46和2662.74 μmol/TEg,显著高于其他果实(P<0.05)。Contessa等[34]的研究发现白穗醋栗表现出高于软枣猕猴桃、蓝莓、黑莓等浆果的抗氧化能力,是良好的抗氧化剂来源[34]。果实多酚对铁离子还原能力(FRAP)由强至弱依次为:黑果腺肋花楸>白穗醋栗>草原樱桃>蔓越莓>软枣猕猴桃;据报道,黑果腺肋花楸的多酚类物质能高度清除机体产生的自由基,如DPPH·、ABTS+·[36];与常见水果相比,黑果腺肋花楸表现出高的抗氧化活性[32],这跟本文研究结果一致。采用ORAC法测得的抗氧化能力由强至弱依次为:软枣猕猴桃>白穗醋栗>草原樱桃>蔓越莓>黑果腺肋花楸。据Wojdyo[37]等的报道软枣猕猴桃对自由基有良好的清除能力。虽然用ORAC法测得的软枣猕猴桃的抗氧化能力最强,为28.37 μmol/TEg,但是它对DPPH·、ABTS+·清除能力很弱;刘庆庆等[38]发现采用DPPH和ORAC法比较不同黄酮类化合物的抗氧化性的结果相反,其抗氧化性跟C环跟B环上的羟基的个数与位置有关。这说明不同多酚的不同结构可能对不同自由基的清除程度产生影响。

2.3 不同果实抗α-淀粉酶活性分析

不同果实对α-淀粉酶活性抑制的动力学曲线,见图1。随着阿卡波糖质量浓度的增加,660 nm处的吸光值逐渐减小,动力学曲线逐渐平缓,说明淀粉浊度变化速率逐渐减小(图1A)。当阿卡波糖质量浓度达到0.33 mg/mL时,反应120 min后,660 nm处的吸光值与对照趋于一致,说明淀粉已被α-淀粉酶完全水解,说明此浓度对α-淀粉酶的抑制效果最佳。当白穗醋栗质量浓度为0.07 mg/mL时(图1B),不到30 min淀粉就被α-淀粉酶水解完全,说明此浓度下α-淀粉酶的活力极高;当白穗醋栗质量浓度提升至0.18 mg/mL时,随着时间的推移,淀粉浊度下降速率减小,此浓度下的白穗醋栗对α-淀粉酶抑制效果最好。同上,蔓越莓(图1C)、草原樱桃(图1D)质量浓度在分别在6.99、9.22 mg/mL时浓度越高,抑制时间越久,表现出对α-淀粉酶较好的抑制能力,不同于以上果实良好的抑制效果,软枣猕猴桃在低质量浓度下(<11.43 mg/mL)的淀粉浊度(OD值越高,淀粉溶液越浑浊)下降较快,直到质量浓度提高到14.67 mg/mL时才表现出对α-淀粉酶有较好的抑制效果(图1E);而黑果腺肋花楸的抑制效果最差(图1F),在质量浓度为18.43 mg/mL时,相比于对照,淀粉浊度迅速下降,对α-淀粉酶几乎无抑制作用。

阿卡波糖是治疗高血糖症的处方药,能有效抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶[39];因此,它被选为参考标准品。不同果实的抗α-淀粉酶活性存在显著性差异,见表3。对α-淀粉酶抑制能力最强的是白穗醋栗,IC50值低于阿卡波糖(0.16 mg/mL),仅为0.122 mg/mL,其AE值为2034.18 mmol AE/g,与阿卡波糖(1550 mmol AE/g)相当,显著高于蔓越莓、草原樱桃、软枣猕猴桃、黑果腺肋花楸,约为它们的42～127倍。另外,蔓越莓、草原樱桃和软枣猕猴桃表现出较强的抗α-淀粉酶活性;而对于黑果腺肋花楸,本试验检测到在浓度为18.43 mg/mL时,对α-淀粉酶活性无明显抑制作用。之前的报道称白穗醋栗中的主要成分是原花青素和酚酸[34],对于白穗醋栗表现出强的抗α-淀粉酶活性,可能与其果实中富含的原花青素有关。Huang等[40]发现何首乌茎中的原花青素低聚物对α-淀粉酶有很强的抑制作用。另外,富含原花青素的高粱麸提取物对α-淀粉酶抑制活性是不含原花青素的黑高粱麸提取物的10倍[41-42]。

表3 α-淀粉酶抑制剂的IC50和阿卡波糖当量(n=3)Table 3 IC50 and acarbose equivalence of inhibitors against α-amylase

2.4 不同果实中总酚含量(TPC)、总花色苷含量(TAC)、抗氧化和抗α-淀粉酶活性之间的相关性分析

如表4所示,对不同果实中总酚含量(TPC)、总花色苷含量(TAC)与抗氧化、抗α-淀粉酶活性之间的相关性进行分析,TPC、TAC均与抗氧化活性(FRAP)之间存在极显著相关关系,并且TPC与抗氧化活性(DPPH)之间也存在极显著相关关系(P<0.01)。据Oszmianski报道,酚类化合物的含量与其抗氧化活性呈正相关关系[43];Francik发现黑果腺肋花楸果实中的花青素具有强大的抗氧化属性,其总花青素含量与抗氧化活性呈显著正相关[44],这些研究均与本文研究结果相符。此外,TPC、TAC与抗α-淀粉酶之间无显著性相关关系。本文研究发现,黑果腺肋花楸TPC跟TAC是5种果树种含量最高的(表1),但其抗α-淀粉酶活性却最低(表3);虽然白穗醋栗TPC仅次于黑果腺肋花楸,TAC最低(表1),但是其抗α-淀粉酶活性最强(表3);因此，果实抗α-淀粉酶活性可能与花青素的关系不大,而与除花青素之外的其他酚类物质存在一定相关性。Tadera对比了花青素、槲皮素、木犀草素、杨梅素等6种类黄酮化合物对α-淀粉酶的抑制作用,发现花色苷的抑制作用较弱[45]。原花青素能够有效抑制碳水化合物水解酶(如α-淀粉酶)的活性[46],其抑制能力高于花青素[47]。但此结论仍需进一步的验证。

表4 五种果实甲醇提取物总酚含量(TPC)、总花色苷含量(TAC)、抗氧化和抗α-淀粉酶活性之间的相关性Table 4 Correlationship between total phenolic content(TPC),total anthocyanin content(TAC),antioxidant capacity and α-amylase inhibitory activity of methanol extracts from five fruits

图1 阿卡波糖及5种不同浓度果实提取物对α-淀粉酶活力的动力学曲线(A1～E1、F)及抑制效果(A2～E2)Fig.1 The kinetic curves(A1～E1,F)and inhibitory activity(A2～E2)of starch hydrolysis by α-amylase in the presence of acarbose and different concentrations of methanol extracts from five fruits注:A:阿卡波糖;B:白穗醋栗;C:蔓越莓;D:草原樱桃;E:软枣猕猴桃;F:黑果腺肋花楸。

3 结论

本研究通过对五种寒地果实的多酚含量、抗氧化活性及抗α-淀粉酶活性分析,发现黑果腺肋花楸的总酚含量跟总花色苷含量显著高于白穗醋栗、草原樱桃、软枣猕猴桃和蔓越莓(P<0.05),白穗醋栗的总酚含量仅次于黑果腺肋花楸;黑果腺肋花楸、白穗醋栗、与软枣猕猴桃表现出高的抗氧化活性;白穗醋栗的抗α-淀粉酶活性显著强于其它四种寒地果实。另外,相关性分析表明,五种寒地果实的TPC、TAC与抗氧化活性之间存在极显著相关关系(P<0.01),与抗α-淀粉酶之间无显著性相关关系。

综上所述,黑果腺肋花楸与白穗醋栗的果实中多酚类物质丰富,是获取天然多酚的良好原料,并且具有良好的抗氧化功效。其中,白穗醋栗对α-淀粉酶活性抑制能力突出,具有优于阿卡波糖的降糖能力,但对其降糖机制仍需探究。