发酵食品工业中的生物安全性评价

黄晓棠,于宏伟,郭润芳

(河北农业大学食品科技学院,河北保定 071000)

《国民营养计划(2017-2030年)》、《“健康中国2030”规划纲要》的实施使大健康产业尤其是功能食品、保健食品行业发展势头迅猛,大量有益健康的功能食品出现在市场上,其中生物活性肽、膳食纤维、高蛋白、不饱和脂肪酸、益生菌和益生元、酵素等备受青睐。2019年最新统计结果显示,2018年我国益生菌产品市场规模达700亿元,预计2020年我国益生菌市场规模将突破800亿元。因此,发酵食品行业迎来前所未有的发展机遇,新型发酵产品尤其是益生菌和酵素已然成为食品工业的新宠。

人类使用发酵方法加工或保存食品以及食用发酵食品有着悠久的历史。发酵食品因其独特的感官特性、营养价值和利于贮藏等特性而在全球各地备受欢迎,并且微生物发酵产生的功能活性物质,有促进肠内营养吸收和消化道健康的有益生理功能,增强认知和神经保护作用,改善人类亚健康状态[1-3]。但发酵食品工业也因此面临着巨大的挑战,那就是食品安全问题。食品在发酵过程中,也会产生一些副产物,有些副产物具有生物危害性,甚至对人体健康有潜在危害。尤其是传统发酵食品,通常是自然发酵工艺,发酵过程较难控制,有害微生物存在将直接导致安全风险。因此,发酵食品工业在注重食品保健功能的同时,有必要对发酵食品的安全性进行评价,这对于保障健康食品,推动健康中国有重要意义。本文对发酵食品的安全性问题、生物安全性评价以及对发酵食品安全性的展望进行了论述,以期对发酵食品工业以及专业领域的研究人员提供一定的参考。

表1 发酵食品类型、产品、发酵微生物以及其功能特性Table 1 Fermented food types,products,fermenting microorganisms and their functional properties

1 发酵食品

发酵食品常用的微生物有酵母菌、乳酸菌、醋酸菌、霉菌等;利用这些微生物发酵的食品通常分为六类,发酵产品也多种多样。表1列举了发酵食品类型、产品、主要发酵微生物以及其功能特性。

2 发酵食品的生物安全性问题

发酵食品是否安全,与发酵菌株和发酵工艺有密切关系。一般来说,纯种发酵工艺条件可控,具有较高的安全性。而传统发酵食品就不可避免的存在一些安全性问题。如发酵过程中产生有毒有害代谢产物及杂菌污染等问题。因此,传统发酵食品的生物安全性问题不容忽视,应引起高度重视。

2.1 发酵菌株的安全性

发酵食品是经发酵菌株代谢而制成的,发酵菌株的安全性直接影响到发酵食品的安全性。菌株对人体的致病性、是否产生有毒代谢物、是否携带抗药基因、溶血基因是发酵菌株首要的安全性问题;其次,随着新食品资源的开发利用,导致新菌株不断涌现,这些菌株安全性得不到保障;即便是在投产时认为安全的菌株,在传代使用过程中,菌株可能会发生退化和变异;最后,基因工程或DNA重组技术已经用来改良不同生产菌株的属性,因此要对使用基因重组技术的发酵食品的安全性进行重新论证。

2.2 发酵过程的副产物

发酵过程中可能会产生一些副产物,如亚硝酸盐、真菌毒素、生物胺等。如在蔬菜腌渍发酵时,会产生副产物亚硝酸盐,长期食用会导致胃癌[16];白酒在发酵过程中可能会产生甲醇等副产物,而这是在生产过程种不可避免的,若饮用甲醇含量高的白酒将会对人体产生危害[17];肉制品中某些发酵微生物可能含有氨基酸脱羧酶,使肉制品中的氨基酸脱羧成生物胺,若过量摄入会有不良反应,特殊情况下生物胺中毒会引起人体器官损害[18]。

2.3 发酵过程中杂菌污染

发酵食品在发酵过程中,可能会被微生物杂菌污染。如在腌渍菜发酵过程中可能会出现膨胀现象,这是因为受到一些产气微生物的影响,包括酵母菌,甚至是大肠杆菌。自然发酵的腐乳可能会出现变红或者变臭等现象,这是因为可能被枯草杆菌、雷黏质沙雷氏菌等杂菌污染[19]。食源性致病菌是全球性重大公共卫生问题,若食用含有致病菌的发酵食品,可能会导致人体患感染性或中毒性疾病,给公众健康带来安全隐患。

食品发酵过程中产生的生物危害物,严重影响了发酵食品的安全性,危害人体健康,亟须采取切实有力的措施予以解决。

3 发酵食品的生物安全性评价

由于发酵食品生产过程中有害微生物或发酵菌株的有害产物均可能有一定安全隐患,因此,准确科学的对发酵食品进行风险识别和安全性评价是控制食品质量安全的前提和保障。

3.1 发酵食品的风险识别

与食品相关的危害,要经过国际食品法典委员会(Codex Alimentarius Commission,CAC)的风险分析程序对潜在风险进行评估,食品风险分析要以国际食品法典委员会的一般性决策以及《国际食品法典风险分析工作准则》作为指导,应用风险分析对化学性危害、微生物危害和营养因素进行评估。

对发酵食品中生物危害进行有效分析时,需要完善的风险评估模型,准确的分析存在的风险隐患因子,进而采取有效的措施解决危害。参照CAC对食品安全风险评估的解释,发酵食品的风险评估可以是指对特定人群在特定时期内暴露于发酵食品中的生物性、化学性等危害所产生的可能不良影响以及与健康相关的风险特征进行的描述。目前应用最广泛的评估手段之一是现代微生物风险评估技术(microbiological risk assessment)。该技术主要包括危害识别﹑危害描述﹑暴露评估﹑风险描述 4个步骤(见图1)[20-21]。

这一方法不仅适合发酵食品中的食源性致病菌的污染风险评估,也可用于发酵有害代谢产物的风险评估。在很多情况下,用这种评估方法未观察到不良反应的暴露水平,可以通过设定适当的安全系数来制定人类的安全摄入水平。

随着科技水平的不断进步和时代的发展,用来识别食品安全风险新技术层出不穷,如用贝叶斯模型与Meta分析技术结合,评估食品质量和安全状况,并识别风险食品[22]。此方法是评估食品风险的有用工具,可评估食品的质量和安全水平。

图1 现代微生物风险评估技术Fig.1 Modern microbiological risk assessment techniques

3.2 发酵菌株的安全性评价

发酵菌株的安全性直接影响到发酵食品的安全性。为了确保菌株对人体安全可靠,国内外很多国家都制定了自己国家的菌株安全性评价体系。

3.2.1 国内外菌株安全性评价体系 FAO/WHO联合专家组在一次会议上制定“食品中益生菌评估导则”,该导则提供了一个对益生菌的安全性全面评估的方法,包括:抗生素耐药性试验、代谢产物毒性检测试验、毒理学评价、溶血性评价以及体外有效评价等[23]。虽然各国所使用益生菌的安全性评价方法各不相同,但总体还是参考这个导则进行评价。

美国对菌株的使用和管理比较严格。新的微生物菌株必须经过GRAS(generally recognized as safe)认可后才能被应用[24],此认可不是由美国食品药品管理局(U. S. Food and Drug Administration,FDA)进行,而是由申请人组织专家评估其菌株的安全性,如果符合GRAS的要求,就可以向FDA通报,FDA只评估通报材料是否可靠[25]。整体来说,美国主要采用“企业自我认可,FDA备案制”对菌株进行安全评估,并使用自己国家相应的标准约束,定期备案更新。

欧洲食品安全委员会(European Food Safety Authority,EFSA)规定菌株安全性评价包括:菌株的组成、营养价值、固有特性研究、动力学研究等,菌株的其它方面也要根据法规规定的原则和程序进行评定[24]。EFSA建立了安全资格认证(Qualified Presumption of Safety,QPS)体系,新的微生物菌株应用前必须经过此体系的评估,评估包括4个方面:分类学地位、相关信息、致病性及最终用途[26]。经过认可的微生物菌株会被收录到QPS列表里,且每年更新一次。

相比世界其他国家,我国对菌株的管理比较落后,基本采用行政审批方式。原卫生部在2010年公布了《可用于食品的菌种名单》[27]、2011年公布了《可用于婴幼儿食品的菌种名单》[27],若要使用名单上没有的菌株,必须向相关部门申请并提交一系列材料,经部门组织专家评审和审批后,符合相关要求的菌株会以公告的形式公布。目前,我国已经批准可用于食品工业生产的菌种共计35种,包括双歧杆菌、乳杆菌、葡萄球菌、乳酸乳球菌等[28]。

各国对发酵菌株的安全性评价方法、评价指标不同,管理制度也不同,因此建立统一的安全性评价系统方法是全世界各国亟待解决的问题。

3.2.2 生物安全性评价

3.2.2.1 菌株抗药性评价 很多研究报道,发酵食品发酵生产过程中均有乳酸菌存在,而有研究表明乳酸菌可能会含有耐药基因,一旦含有耐药基因的细菌进入人体肠道,可能会发生耐药基因水平转移,从而导致人体耐药。因此,对发酵食品的发酵菌株进行耐药性分析及其水平转移是很有意义的。

目前,抗药性评价试验方法主要包括抗生素敏感试验和检测耐药基因及其水平转移性。抗生素敏感试验主要有平板药敏纸品扩散法、打孔法、肉汤稀释法、E-test法等,各有其优缺点[29];而耐药基因检测及水平转移检测则是用特异性引物利用PCR技术检测菌株的抗药性基因,再用滤膜杂交法对抗药性基因的做可转移性分析。Casado等[30]没有检测到具有抗生素抗性菌株的相关抗性基因;Hummel 等[31]研究发现一些菌株对氯霉素不耐药,但具有耐氯霉素基因。这些说明,含有耐药基因的菌株不一定表型表现抗性,耐药基因可能不表达;而不含耐药基因的菌株表型不一定表现敏感。另外,判断菌株耐药界值不一定准确,区分菌株耐药敏感存在质疑。

3.2.2.2 菌株代谢产物毒害性评价 有些菌株代谢后会产生一些有毒害作用的物质,如吲哚、亚硝酸盐类、生物胺类、D-乳酸、溶血素等。这些代谢产物在人体内大量存在时,将导致人体致病或死亡。

a.氨基脱羧酶活性检测

具有氨基脱羧酶活性的细菌能将食品中氨基酸脱羧形成生物胺,若人体大量积累会引起中毒。检测氨基脱羧酶方法有氨基酸脱羧酶试验培养基检测、试剂盒检测、比色法等。Marino等[32]对分离自奶酪里的乳酸菌进行氨基脱羧酶活性检测,结果表明氨基脱羧酶活性在分离菌株中广泛存在;Moreno[33]对分离自不同食物中的78株菌株进行氨基酸脱羧酶检测,其中1株菌含有组氨酸脱羧酶,7株菌含有酪氨酸脱羧酶,56株菌含有精氨酸脱羧酶。

b.D-乳酸检测

根据乳酸旋光性不同,分为D-乳酸和L-乳酸,人体内只含有能分解L-乳酸的酶,若人体D-乳酸含量过多时,会引起代谢紊乱,甚至会引起D-型乳酸血症。D-型乳酸的检测方法主要有试剂盒检测、自动生化分析仪(Technicon RA-XT autoanalyzer)检测、酶法和高效液相色谱法。王梦姣[34]从马奶中分离出7株肠球菌属乳酸菌,并对D-乳酸检测,结果表明有5株菌检测到含有少量的D-乳酸。

c.生物胺检测

生物胺存在于各种发酵食品中,主要包括色胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺等,低浓度下生物胺对许多生理功能至关重要,若人体大量吸收会引起中毒或身体不适症状[35]。生物胺的检测方法有很多,目前主要有高效液相色谱法、气相色谱法、薄层色谱法、传感器法、毛细管电泳法等[36]。但目前还没有明确的监管标准来监测发酵食品中的生物胺含量。FDA规定了水产品的组胺指导水平为50 mg/kg(FDA,2011),EFSA规定了水产品和食品中组胺含量不得高于100 mg/kg。韩国和中国分别限制了海产品组织中的组胺含量,分别为200和200～400 mg/kg[37]。

表2 发酵食品中的生物胺含量Table 2 Biogenic amine content in fermented foods

表2汇总了近年来国内外研究学者检测不同来源发酵食品中生物胺含量[38-42],尽管报道的发酵食品中生物胺含量的范围变化很大,但大多数食品含有潜在危险水平的生物胺浓度。为了确保发酵食品的安全性,需要进一步努力改进食品工艺过程,同时进行风险评估,以及制定管理发酵食品生物胺含量的法规。

3.2.2.3 菌株溶血性评价 微生物溶血有3种类型:α-溶血、β-溶血、γ-溶血,菌株是否溶血可以用血平板划线来检测,是否含有溶血基因用特异性引物通过PCR扩增技术检测。若发酵菌株有溶血现象,菌株可能会含有溶血素或者溶血基因。溶血素能够溶解细胞,直接损伤机体组织,因此会诱导许多疾病的发生。Baumgartner等[43]研究表明一些乳酸菌能够表达某些溶血素,存在一定的安全隐患。

Semedo等[44]研究了肠球菌属的溶血能力和溶血基因,分别在10和14种中发现了β-溶血和cyl基因,表明食品分离株具有毒力潜力,应加强对其安全性评估。

3.2.2.4 毒理学评价 国际上毒理学评价主要包括:动物急性毒性试验,30 d喂养试验及三项致畸致突变试验。Yakabe 等[45]用短乳杆菌KB290对小鼠进行口服剂量毒性试验,结果观察到小鼠无不良反应也无死亡现象。Lu等[46]对新型菌株Phylloporiaribis的发酵菌丝体通过喂养小鼠检测急性和亚慢性毒性,结果小鼠死亡率、总体病理学、组织学、血液学和血液化学均没有影响,食物消耗也没有剂量依赖性变化,这说明急性毒性和亚慢性毒性结果是安全的。

4 展望

随着技术的进步和人类对健康饮食的需求,发酵食品越来越受到人们的青睐。预测2019-2023年,全球发酵食品和饮料市场的复合年增长率(CAGR)将达到7.2%。而且一些传统的发酵食品已从其所在地进入跨国主食。然而大多数传统发酵食品是在不受控制和不卫生的条件下生产的,这必然阻碍其进入新市场。因此,发酵食品的安全性将会直接影响发酵食品工业的健康发展。

从目前的发酵食品安全问题可能出现的缘由来看,今后发酵食品工业需要多方面实施安全举措。首先,国家应加强菌种标准化管理,建立一套菌株的安全性评价方法,促进我国菌株研究和应用的科学健康发展;其次,国家、食品企业、科技人员之间要加强风险交流,不断完善我国发酵食品安全性评价方法。另外,再吸收西式发酵食品技术的基础上,要结合我国的传统发酵工艺,改良现代发酵工艺。同时,也应有目的性的改善食品加工工艺、规范技术标准。总之,我们在注重食品营养功能的同时,也要重视安全问题,只有这样才能实现健康中国梦。