单宁酸对小麦醇溶蛋白结构及功能性质的影响

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(1.华中农业大学食品科技学院,湖北武汉 430070;2.环境食品学教育部重点实验室,湖北武汉 430070;3.湖北省功能食品工程技术研究中心,湖北武汉 430070)

食品体系中往往共存多种大分子和小分子,如蛋白质、多糖、多酚等,它们之间难免会发生相互作用[1]。其中两种组分之间,如蛋白质与多糖、蛋白质与多酚等产生相互作用会改变蛋白质的构象,导致胶体结构(如复合物、纳米颗粒和微胶囊)的形成,进而影响蛋白质的物化性质,实现单一组分不具备的某些功能特性,扩展了其在食品和药品等工业领域的应用。例如,多糖的加入提高了蛋白质在模拟胃液条件下的乳化性[2]。相互作用的类型可分为非共价相互作用(氢键、疏水相互作用和静电力等)与共价相互作用(酶诱导和非酶诱导(碱诱导、自由基诱导)),对此两种相互作用的研究近年来取得一定的进展。例如单宁酸与玉米醇溶蛋白非共价结合可以提高其乳化特性[3],蛋白质与多糖间共价结合可以有效提高蛋白质的稳定性和溶解度[4]。

单宁酸(Tannic Acid,TA)是一种天然多酚,属于一种可水解单宁。它含有约25个羟基,可用来参与氢键、疏水键等非共价键的形成,也可通过氧化后形成醌进行席夫碱等反应参与共价键的形成[5-6]。因此,它可以与许多小分子(生物碱)和大分子(蛋白质、多糖等)反应[7]。由于其广泛的来源和多种生物学特性,如抗氧化、抗菌、抗肿瘤、抗病毒等[8],单宁酸广泛应用于食品工业。小麦醇溶蛋白是谷类中的一种醇溶性蛋白,富含脯氨酸[9]。小麦醇溶蛋白(gliadin)由一个短的N末端,中间重复区域和C末端组成[10],可使其具有两亲特性。近年来,小麦醇溶蛋白由于生物兼容、可生物降解、可生物代谢等优点经常被作为食品添加剂使用,例如肉制品填充剂、面包改良剂等。

小麦醇溶蛋白由于其双亲性,可以自组装形成胶体颗粒。近年来,研究者发现在乳液递送系统中小麦醇溶蛋白纳米颗粒可以作为稳定剂来使用,但单独的小麦醇溶蛋白具有较差的稳定性[11],并且稳定的Pickering乳液只能维持数天[12]。引入单宁酸期望可以改善纳米颗粒的稳定性,增加蛋白稳定Pickering乳液的保质期。

相同的两种组分在不同的处理条件下可能需要不同的组装方式,从而导致不同理化性质的产生。因此基于之前的报道[3,13],实验研究了小麦醇溶蛋白与单宁酸之间通过非共价与碱诱导的共价方式形成复合体系,采用紫外、荧光、红外等技术手段,分析了单宁酸以不同方式结合小麦醇溶蛋白时两者间不同的组装机制,并探究了不同组装机制对小麦醇溶蛋白的结构及功能特性的影响。同时比较了两者通过不同组装机制结合对复合物功能性质的影响,为将两者在乳液递送系统中的应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

谷朊粉 食品级,封丘县华丰粉业有限公司;二氯乙烷 分析纯,国药集团化学试剂有限公司;单宁酸(Mw 1701) 阿拉丁化学试剂有限公司;邻苯二甲醛(OPA)、ABTS(2,2′-azino-di-(3-ethylbenzothiazoline)-6-sulfonic acid)、DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 分析纯,美国Sigma公司。

F-4600荧光分光光度计 日本Hitachi公司;DSC-60差示扫描量热仪、UV-1700紫外-可见分光光度计 日本岛津公司;Nexus470傅立叶红外光谱仪 美国Nicolet公司。

1.2 实验方法

1.2.1 小麦醇溶蛋白的提取 小麦醇溶蛋白的提取过程参考Joye等[14]的方法。在室温下使用二氯甲烷对谷朊粉进行脱脂2 h(谷朊粉/二氯甲烷溶液为1∶7,w/v)后,抽滤收集粉末。并将上述过程重复2次,将得到的粉末室温下干燥12 h,至溶剂挥发完全。干燥后将粉末加入70%(v/v)乙醇-水溶液中(粉末/溶液为1∶10,w/v),搅拌3 h,然后以9000×g 4 ℃的条件离心10 min收集上清液。在40 ℃下旋蒸30 min除去乙醇,直至有少量粉末析出。最后,将所得悬浊液冷冻干燥后收集小麦醇溶蛋白,并用研钵研至粉末状。通过氮分析仪(FP-428,Leco Corp.,St. Joseph,MI,USA)分析粉末中蛋白含量为88.86%。

1.2.2 小麦醇溶蛋白/单宁酸复合物制备 小麦醇溶蛋白/单宁酸的非共价/共价复合物的制备过程参考已报道的研究方法[15]。将醇溶蛋白和单宁酸溶于70%(v/v)乙醇-水溶液中,用0.2 mol/L NaOH调至pH9.0,使其充分接触空气(敞口搅拌)并在室温下搅拌24 h。得到的溶液再在室温下静置24 h来确保完全分散和溶解,所得溶液为小麦醇溶蛋白/单宁酸共价复合物溶液(标记为共价复合物)。所用小麦醇溶蛋白与单宁酸的质量比为1∶0.01～1∶0.09 (w/w),对应图1中小麦醇溶蛋白浓度固定时,相对应的单宁酸浓度为0.29、0.87、1.45、2.03、2.61 μmol/L。相同条件下不添加单宁酸制得碱处理后的蛋白样品(标记为gliadin,经碱处理)。

非共价复合物(标记为非共价复合物)在以上述方式但不调节pH与隔绝氧气(闭口搅拌)的条件下制备而得,以此相同条件不添加单宁酸时制得对照蛋白溶液(标记为gliadin)。

1.2.3 小麦醇溶蛋白/单宁酸复合物的荧光光谱分析

1.2.3.1 荧光光谱的测定 室温条件下,小麦醇溶蛋白的内源荧光用荧光分光光度计检测。小麦醇溶蛋白浓度固定为0.5 mg/mL,非共价复合物的测定中所用单宁酸浓度依次为0.005、0.015、0.025、0.035、0.045 mg/mL,共价复合物的测定中所用单宁酸浓度为0.025 mg/mL。其中激发波长设置为290 nm,发射波长为280～500 nm[16],激发和发射狭缝宽均为5 nm。

1.2.3.2 淬灭类型分析 利用Stern-Volmer方程对荧光数据进行分析,以求得淬灭类[17]。

式(1)

式中:F-有淬灭剂时小麦醇溶蛋白的荧光强度;F0-无淬灭剂时小麦醇溶蛋白的荧光强度;Kq-速率常数;t0-没有淬灭剂时生物大分子的平均荧光寿命;[Q]-淬灭剂浓度;Ksv-Stern-Volmer淬灭常数。

针对静态淬灭与动态淬灭同时存在的情况,利用Stern-Volmer方程修正形式进行分析[18]。

式(2)

式中:F0、F、[Q]代表含义同上;KD-动态淬灭常数;KS-静态淬灭常数。

1.2.3.3 结合位点计算 通过以下方程计算结合常数和结合位点[19]:

式(3)

方程中:Ka-结合常数;n-结合位点数。

1.2.3.4 热力学参数计算 热力学参数通过以下公式计算得到[20]:

式(4)

ΔG=ΔH-TΔS

式(5)

方程中:R-气体常数,空气的气体常数约为8.314 J/(mol·K);T-实验温度(开氏度);Ka-与温度T对应的结合常数。

1.2.4 小麦醇溶蛋白/单宁酸复合物的自由氨基含量测定 本实验采用邻苯二甲醛(OPA)法[21]测定蛋白与复合物中自由氨基的含量。准确称取80 mg邻苯二甲醛溶于2 mL乙醇中,然后依次加入50 mL 0.1 mol/L硼砂,200 μL巯基乙醇,和5 mL 20%(w/w)十二烷基硫酸钠(SDS),定容至100 mL,此为OPA试剂。测定时取4 mL OPA试剂于试管中,将1.2.2中所得到的小麦醇溶蛋白或复合物溶液稀释至适当浓度后注入400 μL于试管中,室温下混匀后反应2 min,340 nm下测量吸光值。以4 mL OPA试剂中加入 400 μL 70%乙醇-水溶液为空白。以L-亮氨酸作标准曲线,根据曲线与测得的吸光度算出样品中自由氨基的含量。

1.2.5 傅立叶变换红外光谱分析(FTIR) 采用溴化钾压片法测定红外光谱。将1.2.2中所得溶液冻干后得到小麦醇溶蛋白与复合物粉末,将冻干后的粉末与溴化钾以1∶100 (w/w)的比例进行混合,烘干后用玛瑙研钵研磨至均匀粉末后压制成片。光谱的扫描范围是4000～400 cm-1,采用溴化钾为空白对照。采用PeakFit v 4.12进行处理,利用高斯去卷积和求二次导数的方法对酰胺I带区域(1700～1600 cm-1)的原始光谱进行分析。利用Thermo Scientific OMNIC软件对FTIR光谱进行基线校正。通过对酰胺I带区域进行二阶求导,蛋白质二级结构的主要峰可以分为α-螺旋(1646～1664 cm-1),β-折叠(1615～1637 cm-1和1682～1700 cm-1),β-转角(1664～1681 cm-1)和无规则卷曲(1637～1645 cm-1)。通过高斯方程计算各个峰的面积所占百分比来对比二级结构的变化。

1.2.6 紫外可见吸收光谱分析(UV-visible) 将1.2.2中所得样品溶液稀释至适当浓度后置于1 cm比色皿中测量。波长的扫描范围是190～400 nm,扫描速度为200 nm/min。

1.2.7 复合物热稳定性及抗氧化性分析

1.2.7.1 差示扫描量热分析(DSC) 取5.0 mg 1.2.5中冻干得到的粉末,置于铝盘中并进行密封,以密封空铝盘作为空白对照。升温速率设为10 ℃/h,加热范围为25～150 ℃,氮气流速为30 mL/min。

1.2.7.2 DPPH自由基清除活性 自由基清除活性参考Gong等[22]的方法。1 mmol/L DPPH乙醇溶液,置于4 ℃冰箱中储藏以备使用。使用时将DPPH用乙醇稀释至0.1 mmol/L。试验中将1.2.2中所得溶液稀释至适当浓度后,取20 μL与3.8 mL DPPH乙醇溶液混合20 s后,暗中储藏1 h,在517 nm下测量吸光值。

式中:As为样品吸光度;Ac为空白对照的吸光度。

1.2.7.3 ABTS自由基清除活性 ABTS自由基清除活性参考Pellegrini等[23]的方法。将5 mL ABTS(7 mmol/L)母液与5 mL 过硫酸钾溶液(2.45 mmol/L)混合,并避光静置12 h以上,制备成ABTS工作液。实验时将工作液用乙醇稀释至λ734=0.7±0.02。将1.2.2中所得溶液稀释至适当浓度后,取0.1 mL与3.9 mL ABTS工作液充分混合后并在黑暗环境下静置8 min,734 nm下测量吸光值。通过以下方程计算ABTS自由基清除活性:

式中:As是样品吸光度,Ac是空白对照的吸光度。

1.3 数据处理

数据统计分析使用SPSS 19.0软件进行单因素ANOVA检验,显著水平为0.05。所有测试至少进行3次,数据为三次测定的平均值,结果以平均值±标准差(SD)表示。

2 结果与分析

2.1 单宁酸与小麦醇溶蛋白反应作用力探究

图1 小麦醇溶蛋白/单宁酸非共价复合物荧光发射图谱Fig.1 Fluorescence emission scans ofgliadin/TA non-covalent complex注:A到F分别表示不同单宁酸浓度下小麦醇溶蛋白的内源荧光。

2.1.1 荧光光谱分析 图1为小麦醇溶蛋白/单宁酸非共价复合物的荧光发射图谱。小麦醇溶蛋白的最大发射波长约在340 nm,这与醇溶蛋白之前报道过的最大发射波长相似[24]。相比于水溶液中色氨酸的最大发射波长在约355 nm处,最大发射波长有所偏移。这是由于本实验采用的溶剂为70%乙醇-水溶液,相对于水溶液来说,70%乙醇-水溶液的溶剂极性降低,所以造成色氨酸的最大发射波长蓝移。随着单宁酸浓度的增加,最大发射波长发生红移,表示复合物的疏水性增加,可能是单宁酸的结合导致蛋白质分子结构更加舒展而使更多疏水基团暴露出来所致。

图2 小麦醇溶蛋白的Stern-Volmer曲线(A)及其修正曲线(B)Fig.2 Stern-Vlommer curve(A)and the modifiedform of Stern-Volmer equation(B)of gliadin

根据式1分析荧光淬灭类型。图2A代表三个温度下Stern-Volmer方程的分析结果,不同温度下的Stern-Volmer图均表现了向上曲率,且向y轴凹。此结果表明单宁酸对醇溶蛋白的淬灭机制是静态淬灭与动态淬灭同时存在的[16]。基于此结果,引入式(2)分析荧光淬灭数据。

表1 小麦醇溶蛋白/单宁酸非共价相互作用的热力学参数Table 1 Thermodynamic parameters of the non-covalent interaction of gliadin and TA

图2B显示了不同温度下单宁酸对醇溶蛋白的淬灭曲线,单宁酸与醇溶蛋白间的Stern-Volmer淬灭常数Ksv(Ksv=KD+KS)在30、35、40 ℃三个温度下分别为0.2600×106、0.4515×106和1.1433×106M-1。根据已知的Ksv和色氨酸的t0为3 ns[25]可以算出速率常数Kq(Kq=Ksv/t0)分别为8.67×1012、1.51×1013和3.81×1013M-1s-1。在动态淬灭中,最大碰撞淬灭常数为 2.0×1010M-1s-1,本研究中得到的淬灭速率常数远大于2.0×1010M-1s-1。单宁酸的加入引起了醇溶蛋白荧光分子吸收光谱的红移,可以推测单宁酸与醇溶蛋白的淬灭机制中静态淬灭占主导地位,并且两者之间形成了复合物。

利用式(3)分析小麦醇溶蛋白与单宁酸的结合位点数与结合常数。如图3为单宁酸淬灭醇溶蛋白的双对数曲线,在30、35、40 ℃时,单宁酸与醇溶蛋白之间的结合常数Ka分别为6.74×109M-1(lg(F0-F)/F=9.8289+1.5987 lg[Q])、6.24×109M-1(lg(F0-F)/F=9.7953+1.5875 lg[Q])和1.42×108M-1(lg(F0-F)/F=8.1546+1.2905 lg[Q])。数据表明从30 ℃到40 ℃,单宁酸与小麦醇溶蛋白的结合常数Ka较大,说明两者间具有较强的结合力。随着温度升高,表观结合常数降低,表明温度升高对两者间的结合不利,复合物变的相对不稳定。结合位点数n分别为1.5987、1.5875和1.2905,说明两者大约是以1∶1(摩尔比)的比例结合[16]。

图3 单宁酸与小麦醇溶蛋白相互作用的双对数曲线Fig.3 Double-lg plots of interactionbetween TA and gliadin at different temperatures

根据式(4)、式(5),焓变(ΔH)和熵变(ΔS)可以通过lnK对1/T曲线的斜率与横坐标估算得到。据图4和表1可知,ΔG<0表明两者间为自发的反应。并且单宁酸与醇溶蛋白反应的ΔH<0,且ΔS<0,故可推断两者间主要是通过氢键相结合[26]。

图4 单宁酸与小麦醇溶蛋白相互作用的热力学参数Fig.4 Thermodynamic parameters for interactionbetween TA and gliadin at different temperatures

2.1.2 自由氨基的变化 本研究采用邻苯二甲醛(OPA)法检测蛋白质中的自由氨基含量,可以用来反应赖氨酸侧链的相关信息[27]。由表2可知,相同单宁酸含量下,共价复合物中自由氨基含量比非共价复合物中的自由氨基含量低。因加入的SDS可以破坏非共价键,所以自由氨基含量的降低说明了碱处理会使醇溶蛋白中的自由氨基-NH2与氧化后的单宁酸发生席夫碱反应[28],生成C-N键,醇溶蛋白与单宁酸形成共价复合物。与此同时,体系内随着单宁酸含量的增加,同一复合物体系中自由氨基含量也随之增加,其原因可能是由于单宁酸的结合,蛋白分子结构发生去折叠,导致更多的氨基暴露出来,因此会使得自由氨基含量增加。

表2 小麦醇溶蛋白和小麦醇溶蛋白/单宁酸复合物的自由氨基含量Table 2 Free amino groups of gliadinand gliadin/TA complexes

注：同行不同字母表示差异显著(P<0.05)。

2.2 结构的变化

2.2.1 三级结构的变化

2.2.1.1 紫外光谱的测定 通过紫外可见光谱来探究单宁酸对于小麦醇溶蛋白三级结构的影响。图5A的紫外吸收光谱可清晰的观察到280 nm附近存在一个吸收峰,此吸收峰主要由色氨酸和酪氨酸残基产生。引入单宁酸后该吸收峰的强度增加说明小麦醇溶蛋白与单宁酸间形成了复合物并进一步改变了蛋白的三级结构。非共价与共价两种复合物的吸光度分别比小麦醇溶蛋白与经碱处理的小麦醇溶蛋白的吸光度高,说明单宁酸的结合导致蛋白三级结构展开,使得芳香杂环疏水基团周边的微环境极性增大[29-30]。此外,共价复合物的吸光度明显高于非共价复合物的吸光度,表明共价交联方式使得小麦醇溶蛋白分子更加伸展,导致更多的芳香杂环疏水基团暴露。

2.2.1.2 内源荧光的测定 通过内源荧光光谱来探究单宁酸对于小麦醇溶蛋白三级结构的影响。图5B可以看出经过碱处理后,醇溶蛋白的内源荧光强度增强,可能是由于碱处理改变了蛋白质中色氨酸的内环境所致。基于先前的研究结果,多酚的芳环可以与蛋白质的色氨酸或酪氨酸反应,造成蛋白内源荧光淬灭[31]。因此,复合物的荧光淬灭也进一步表明醇溶蛋白与单宁酸之间发生了相互作用。与非共价复合物相比,共价复合物中醇溶蛋白的内源荧光强度更低,说明共价相互作用更强,单宁酸会与色氨酸侧链上的自由氨基不可逆交联。最大发射波长发生蓝移,说明色氨酸处于非极性环境下;而当蛋白分子三级结构开始伸展,色氨酸更多的暴露在极性环境下时,最大发射波长会发生红移[32]。与醇溶蛋白相比,复合物的最大发射波长发生红移,说明形成复合物时蛋白分子发生去折叠,使色氨酸暴露在更加亲水的环境中。与非共价复合物相比,共价复合物的最大发射波长红移的程度更深,说明共价交联对蛋白的三级结构影响更多。

图5 小麦醇溶蛋白和小麦醇溶蛋白/单宁酸复合物的紫外可见图谱(A)与荧光发射图谱(B)(gliadin∶TA=1∶0.05,w/w)Fig.5 UV-visible spectra(A)and fluorescence spectra(B)ofgliadin and gliadin-TA complexes(preparedwith a gliadin/TA ratio of 1∶0.05,w/w)

图7 小麦醇溶蛋白和小麦醇溶蛋白/单宁酸复合物的二级结构酰胺I带拟合曲线Fig.7 Curve-fitted amide I region with secondary structure determination 注:A:醇溶蛋白;B:非共价复合物;C:醇溶蛋白(经碱处理);D:共价复合物;醇溶蛋白∶TA=1∶0.05 (w/w)。

2.2.2 傅立叶变换红外光谱分析 图6为冻干并烘干去除水分后小麦醇溶蛋白和小麦醇溶蛋白/单宁酸复合物的红外光谱图。如图6A单宁酸在3385 cm-1处的特征峰代表酚基或羟基的伸缩振动[33],该峰在单宁酸如图6A,单宁酸在3385 cm-1处的特征峰代表酚基或羟基的伸缩振动[33],该峰在单宁酸与小麦醇溶蛋白反应之后发生右移,说明单宁酸的羟基或酚基参与了两者间的反应。与小麦醇溶蛋白反应之后发生右移,说明单宁酸的羟基或酚基参与了两者间的反应。1716 cm-1是酯键基团的特征峰,1613、1533、1448 cm-1是由于苯环的骨架振动产生[34]。小麦醇溶蛋白的光谱表现出的主要峰值为3312(酰胺A带,N-H的伸缩振动)、1659(酰胺I带,C=O的伸缩振动)和1540 cm-1(酰胺II带,C-N的伸缩振动和N-H的平面弯曲振动)。在与单宁酸形成复合物后,主要峰分别移动到3215、1662和1537 cm-1,说明了氢键相互作用的存在,与之前非共价复合物荧光结果一致(图1D)。图6B中所示两条线段a和b代表一样的长度,可看出随着单宁酸含量的增加,1540 cm-1处的吸收峰强度明显变弱,说明两者间发生了化学反应[35-36]。1258 cm-1代表OC-NH伸缩振动,引入单宁酸后,该峰吸收明显增强,说明反应过程中有C-N键的形成[37]。1540 与1258 cm-1处吸收峰强度分别变弱和增强,共同说明了单宁酸与小麦醇溶蛋白在碱诱导过程中发生了化学反应。

表3 小麦醇溶蛋白和小麦醇溶蛋白/单宁酸复合物的二级结构含量(%)Table 3 Secondary structure content of gliadin and gliadin/TA complexes(%)

图6 小麦醇溶蛋白和小麦醇溶蛋白/单宁酸复合物的红外光谱Fig.6 FTIR spectra of gliadin and gliadin/TA complexes注:A:非共价复合物;B:共价复合物,图中所示比例为醇溶蛋白∶TA(w/w)。

由于蛋白质的红外光谱通常伴随着二级结构的改变,本研究进一步采用傅立叶自解卷积的方法对1600～1700 cm-1区域的红外光谱进行高斯线性拟合,得到蛋白质的二级结构信息。如图7和表3所示,经过碱处理后小麦醇溶蛋白中α-螺旋含量从32.46%增加到38.03%,β-折叠、β-转角和无规则卷曲的含量均有不同程度的下降。形成非共价复合物时的小麦醇溶蛋白分子中α-螺旋和β-转角的含量比未与单宁酸结合时的小麦醇溶蛋白分别降低3.34%和1.43%,β-折叠和无规则卷曲的含量分别增加1.12%和1.65%。形成共价复合物时的小麦醇溶蛋白中α-螺旋的含量比经过碱处理的小麦醇溶蛋白降低9.31%,β-折叠、β-转角和无规则卷曲的含量分别增加5.43%、2.26%和1.62%。结果表明单宁酸的结合会使蛋白的二级结构变的更加无序,同时以共价交联方式形成复合物会使蛋白的二级结构改变更多。这可以用来解释表2中非共价复合物和共价复合物中的自由氨基随着复合物中单宁酸含量的增加分别增多的现象,单宁酸的加入使蛋白去折叠,游离氨基更多的暴露了出来。

2.3 功能特性的变化

2.3.1 热稳定性 通过差示扫描量热(DSC)可以反应单宁酸的结合对于小麦醇溶蛋白热稳定性的影响。图8可以看出小麦醇溶蛋白在 60.94 ℃存在一个吸热峰,这代表蛋白质的热变性温度。经过碱处理后蛋白的吸热峰变为62.76 ℃,这表明采用碱处理的方法可以使蛋白的热稳定性小幅度增加。非共价复合物的热变性温度为55.55 ℃,共价复合物的热变性温度为63.78 ℃。表明单宁酸采用非共价方式与醇溶蛋白相互作用时,不利于蛋白的热稳定性,而醇溶蛋白通过共价键与单宁酸结合可以提高其热稳定性,这与之前报道过的结果相似[38]。

图8 小麦醇溶蛋白和小麦醇溶蛋白/单宁酸复合物的差示扫描量热图谱Fig.8 DSC analyses of gliadin and gliadin/TA complexes

2.3.2 抗氧化活性 通过DPPH和ABTS自由基清除实验可以反应单宁酸的结合对于小麦醇溶蛋白抗氧化活性的影响。图9表示出了各个样品的抗氧化活性,小麦醇溶蛋白本身不具有抗氧化活性,单宁酸的加入使复合物具有了抗氧化活性。这是由于单宁酸的羟基对于抗氧化能力有较大的贡献[39],两者形成复合物后相对于小麦醇溶蛋白引入了更多的羟基,使其抗氧化活性得到提高。相比于游离单宁酸,单宁酸与小麦醇溶蛋白结合后对其本身的抗氧化能力有一定的抑制作用,这可能是由于单宁酸上一部分羟基参与了与蛋白间的相互作用所致。共价复合物的抗氧化能力比非共价复合物的抗氧化能力小,是由于在使用碱交联的方法形成共价复合物时,单宁酸上的羟基氧化生成醌[40],导致了羟基数量的减少,从而造成抗氧化能力的进一步降低。

图9 小麦醇溶蛋白和小麦醇溶蛋白/单宁酸复合物的抗氧化性 Fig.9 Antioxidant activities of gliadinand gliadin/TA complexes

3 结论

目前,为了扩展蛋白在食品工业中的应用,蛋白质与多酚间的非共价相互作用已被研究的较为透彻。本实验从探究两者间非共价与共价相互作用力出发,对比了形成的两种复合物对蛋白质的结构、热稳定性与抗氧化性方面造成的差异,为蛋白质在食品中的应用增加了新的可能性。实验采用简单的碱处理方法,使单宁酸可以成功接枝到小麦醇溶蛋白分子上并与其侧链上的氨基发生反应。非共价复合时,小麦醇溶蛋白与单宁酸主要通过氢键相互作用进行静态结合,并且结合常数大约为1∶1。与单宁酸复合后,蛋白中α-螺旋含量降低,β-转角含量升高,蛋白分子结构展开,导致蛋白分子中自由氨基含量升高。与非共价结合方式相比,共价交联方式对蛋白的二、三级结构影响更大。非共价复合使小麦醇溶蛋白的热变性温度降低,而共价结合方式使小麦醇溶蛋白的热变性温度小幅度提升。单宁酸的引入使蛋白具有了抗氧化活性,非共价复合物的抗氧化性强于共价复合物。