新工艺制备Hib 结合疫苗原液长期稳定性试验

朱文勇，王明清，宋绍辉，李双丽，胡文著，廖国阳

（中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室，云南昆明 650118）

b 型流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae type b，Hib），是引起小儿细菌性脑膜炎和急性呼吸道传染病的主要致病菌，也可导致败血症、会厌炎、脊髓炎等多种侵袭性疾病[1-2]。目前，Hib 结合疫苗是国际公认的最为有效的细菌性疫苗之一[3]。目前上市的Hib 结合疫苗，都是由Hib 荚膜多糖经活化，通过己二酰肼（adipyl dihydrazide，ADH）与破伤风类毒素（tetanus toxoid，TT）蛋白共价结合制备而成。其中荚膜多糖的提取均采用传统工艺[4]，过程中使用大量的苯酚，而多糖活化也采用极毒的溴化氰，严重影响操作者的身体健康，破坏生态环境。为此，国内外开展了细菌荚膜多糖提取新工艺[5-8]及疫苗制备新方法的研究[9-12]，其中笔者所在团队建立了利用Triton X-114 提取Hib 荚膜多糖的新工艺[13]及基于1-氰基-4-二甲基氨基吡啶·四氟化硼（1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate，CDAP）活化的疫苗制备新方法[14]也做了相应研究，初步结果证明，新工艺所制备Hib 结合疫苗质量和效果完全达到目前新版药典要求，但如真正投入生产还需对其稳定性进行检测。本研究通过对制备疫苗的长期稳定性进行监控，为新工艺投入生产提供试验数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

多糖及载体蛋白多糖3 批（批号：20120301、20120512、20130218）载体蛋白3 批（破伤风类毒素，TT）（批号：20110506、20110712、20110920），均由中国医学科学院医学生物学研究所制备。实验动物Bablb/c 小鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（湘）-2013-0004，豚鼠，兔均购自昆明楚商科技有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（滇）K2012-0002。CDAP、ADH、碳二亚胺[1-ethyl-3-（3-dimethylaminopmpylcarbodiimide，EDAC]均购自美国Sigma 公司。Hib 抗血清、HRP标记羊抗鼠IgG 抗体均购自美国BD 公司。TT 抗体购自中国食品与药品检定研究院。NaCl（药用级）购自自贡鸿鹤公司。AKTA 纯化仪及填料购自美国GE 公司。

1.2 结合疫苗原液的制备

Hib 菌株发酵后经Triton X-114 方法提取荚膜多糖[13]，荚膜多糖经CDAP 活化后，与ADH 在碱性条件下衍生，制备出多糖-酰肼基衍生物，在EDAC 作用下与TT 偶联，形成多糖-蛋白结合物，经Sepharose 4FF 纯化，收集KD≤0.2 的结合物，用0.22 μm 滤膜除菌过滤，即为Hib 结合疫苗原液，后经稀释为Hib 结合疫苗。本实验所用3 批Hib 结合疫苗批号分别为：20130402、20130403、20130504。

1.3 Hib 结合疫苗原液检定

鉴定项目与方法均参照2010 年《中国药典》三部中《b 流感嗜血杆菌结合疫苗制造检定规程》中规定进行。本实验设计2-8℃长期稳定性试验，具体检定项目与检定时间见表1。

2 结果

按照2010 年《中国药典》三部中规定中的方法对制品进行了稳定性试验，Hib 结合疫苗2～8℃保存了36 个月，结果见表1，其指标中鉴别试验、pH 值、多糖含量、无菌、异常毒性、热源、细菌内毒素含量结果稳定，每次检测结果差异不大，分子量大小随时间增长略有下降，高分子结合物含量及效力试验结果变化显著，保存30 个月时，仍能达到《b 流感嗜血杆菌结合疫苗制造检定规程》80%～100%的要求，阳转率也能维持在80%，符合药典要求。保存36 个月时，201304003 批疫苗高分子结合物含量低于80%，效力试验阳转率也低于80%，不符合药典要求。

3 讨论

稳定性试验是疫苗质量控制研究的主要观察项目之一，目的在于考察疫苗的质量稳定性，为疫苗在合理有效期或使用期提供科学依据[15]。原则上一般包括3 种方式[12]：（1）强制条件试验研究，用于了解产品在短期偏离储存条件和极端情况下产品的变质或降解情况；（2）加速稳定性研究，用于确定产品在处理和使用过程中引起的降解，数据可作为制定有效期的辅助依据；（3）实际储存条件下的实时稳定性研究（长期稳定性研究），研究可以作为设定产品保存条件和有效期的主要依据。

本研究主要检测了新工艺制备的Hib 结合疫苗的长期稳定性试验，验证了该工艺在储存条件（2～8℃）下，保存30 个月仍符合2015 年《中国药典》三部的质量标准，初步说明该疫苗能够满足2 年有效期要求，与传统工艺制备Hib 结合疫苗结果[3]类似，为新工艺投入生产提供了依据。但是，

如上述稳定性试验研究原则所述，为全面评估该疫苗应对运输、极端环境及生产处理中的各种情况，后续仍应该对其进行强制稳定性试验和加速稳定性试验研究。通过本研究发现，在疫苗的储存过程中，其鉴别试验、pH 值、多糖含量及异常毒性等关乎安全性的指标相对稳定，而其高分子结合物含量与效力试验变化较明显，且两者结果具有相关性，这提示我们在后续实验及生产过程中应重视高分子结合物含量的指标，同时应该进行更多批次的疫苗稳定性试验，对试验数据进行科学统计，制定出合理的企业内部生产放行标准，以免上市疫苗达不到预期效果。

表1 Hib 结合疫苗原液2～8℃长期稳定性实验检测结果（1）Tab.1 Long term stability results of Hib conjugate stock solution at 2～8 ℃（1）

表1 Hib 结合疫苗原液2～8℃长期稳定性实验检测结果（2）Tab.1 Long term stability results of Hib conjugate stock solution at 2～8 ℃（2）

表1 Hib 结合疫苗原液2～8℃长期稳定性实验检测结果（3）Tab.1 Long term stability results of Hib conjugate stock solution at 2～8 ℃（3）