Aβ25-35联合D-半乳糖诱导树鼩AD 模型的建立

郭玉倩 ，曾跃勤，吴 超，陆姜利，杨 艺，郑 红，梁 张

（1）昆明医科大学实验动物学部；2）分子临床研究院；3）科技处，云南昆明 650500）

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是常见的原发性老年性神经退行性疾病，是最常见的痴呆类型。临床表现主要为进行性记忆力下降、认知功能障碍、行为异常和人格失常等。我国每年新增大约30 万患者[1]。AD 患病率与年龄密切相关，年龄平均每增加6.1 岁，患病率升高1 倍；在85 岁以上老年人群中，AD 患病率可高达20%～30%。到2050 年，全球AD 患者将超过1 亿[2]。AD 不仅给患者带来巨大的痛苦，还给家庭和社会带来了沉重的精神压力和医疗、照料负担。由于发病原因不明确和发病机制复杂性，目前AD 治疗药物均不能逆转疾病进程[3]。因此，建立适宜的AD 动物模型有利于开展发病机制、药物研发和机理研究[4]。笔者以树鼩为研究对象，通过海马内注射Aβ25-35、皮下注射D-gal 和联合给药3 种方式建立AD 模型，旨在为AD 的研究提供理想的动物模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物

24 只雄性树鼩来源于昆明医科大学实验动物学部，许可证：SCXK（滇）2015-0002）；实验树鼩饲料、饲养笼均由昆明医科大学实验动物学部提供，动物自由饮水，单笼饲养。饲养室温度（22±2）℃，相对湿度50%～60%。

1.2 主要仪器

脑立体定位仪（成都仪器厂），水迷宫行为测试系统（成都泰盟公司），组织切片机、烤片机、包埋机（德国leica 公司），显微镜（日本尼康公司），恒温培养箱、冰箱（美国Thermo），粘附载玻片（福州迈新公司）。

1.3 主要试剂

Beta 淀粉样蛋白25-35、D-半乳糖（Sigma公司），兔抗鼠Aβ1-42一抗（Abcam 公司），PBS磷酸缓冲液（Solarbio 公司），柠檬酸钠、多聚甲醛、快捷型山羊抗兔/小鼠IgG（福州迈新公司），中性树胶（南京建成公司）。

1.4 方法

1.4.1 Aβ25-35 的孵育参照Zheng 等[5]方法，用生理盐水将Aβ25-35（5 mg/mL）配制成溶液，放置在37℃恒温培养箱孵育7 d，用于树鼩海马注射。

1.4.2 动物分组及处理24 只雄性树鼩，体重135～145 g，随机分为对照组（CT），D-半乳糖组（D），Aβ 组（A），D-半乳糖联合Aβ25-35（D+A）组。用3%戊巴比妥（30 mg/kg）腹腔注射麻醉树鼩。Aβ25-35在立体定仪下向A 组和D+A 组海马中1 次性注射4 μL 的Aβ25-35（5 mg/mL）；CT 和D 组注射等量生理盐水，术后所有树鼩肌肉注射青霉素[22 000 U/(kg·d)]连续3 d，预防感染。向D 组和D+A 组皮下注射D-半乳糖[125 mg/(kg·d)]，对照组和Aβ25-35组给予等量生理盐水，连续8 周。

1.4.3 Morris 水迷宫检测（MWM）在第9 周进行，每天早上9:00 点开始测试。泳池直径1.6 m，水温（21±1）℃。第1 天为搜索平台的适应训练，水迷宫设置为可见平台，将树鼩面朝向池壁，距水面高度10 cm 放下，30 s 后若树鼩没有找到平台，将其引导上平台。在平台停留10 s 后，把树鼩取出、充分擦干身体。第2～6 天进行定位巡航实验，设置为距水面下1 cm 的隐藏平台，实验操作同第1 天，记录树鼩找到平台的时间，如30 s 未找到平台，逃避潜伏期记为30 s。第7 天进行空间搜索实验，撤去平台，记录树鼩通过原平台位置的次数、运动轨迹。

1.4.4 免疫组化检测水迷宫实验结束后，心脏采血处死树鼩，生理盐水和多聚甲醛灌注固定树鼩脑组织，取大脑制成5 μm 石蜡切片，经脱蜡、柠檬酸钠修复、封闭、兔抗鼠Aβ1-42一抗孵育、二抗孵育、DAP 显色、苏木素染色、乙醇梯度脱水、二甲苯透明后，封片。显微镜下观察大脑皮层和海马细胞形态和Aβ1-42的表达。

1.5 统计学处理

实验结果得到的数据均采用SPSS 进行处理分析，树鼩脑片免疫组化染色结果采用image J 进行定量，所有数据以平均数±标准差表示，组间比较使用单因素方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 树鼩Morris 水迷宫

定位巡航实验中，从第4 天至第6 天，D-半乳糖组、Aβ25-35组和D-半乳糖联合Aβ25-35（D+A）组逃避潜伏期延长，与对照组（P＜0.01；图1a）具有差异极显著性；在第6 天，D+A 组（P＜0.05；图1A）逃避潜伏期显著长于D-半乳糖组、Aβ25-35组。在空间搜索实验中，结果显示相对于对照组相比（P＜0.05；图1A），D、A 和D+A组穿越平台次数均显著性降低；D+A 组（P＜0.05；图1A）穿越平台次数显著低于单因素诱导的D-半乳糖组和Aβ25-35组。

2.2 树鼩海马与皮层中Aβ1-42 的表达

免疫组化结果显示，在树鼩海马中，对照组神经元形态完整，胞质和细胞核结构清晰，细胞排列紧密。D 组、A 组和D+A 组细胞排列相对松散、核固缩，胞质内呈现不同程度棕色。对阳性面积定量分析显示，D 组、A 组和D+A 组显著高于对照组（P＜0.05；图1B，Hip），而D+A 组Aβ1-42的表达最多，显著高于D 组和A 组。树鼩的大脑皮层中也有类似的结果，3 个处理组细胞固缩明显，胞质内呈现不同程度棕色。定量分析显示，D 组、A 组和D+A 组显著高于对照组（P＜0.05；图1B，Cor），而D+A 组（P＜0.05）Aβ1-42的表达显著高于D 组和A 组。

图1 树鼩不同处理水迷宫实验和大脑Aβ1-42表达分布情况（n=6）Fig.1 Morris water maze and Aβ1-42IHC（n=6）

3 讨论

为了探究AD 的机制和潜在治疗药物，建立合适的动物模型是关键的一步。理想的AD 动物模型将为解决药物靶点不明、临床前后药效学不一致等问题提供有力工具[6]。大小鼠等啮齿类动物是最常用的AD 模型，因其繁殖力强、利于大规模饲养、成本低和易于操作等优点广泛用于AD 动物模型研究。但由于与人类亲缘关系较远，仅能模拟部分病理学特征[7]。其他的动物模型，如犬和果蝇等也有局限性[8]。目前灵长类动物被广泛认为是最合适的AD 动物模型，但由于价格昂贵，饲养的经济和空间成本高、实验周期长等缺点，尚难以广泛应用。因此具有类似灵长类动物特征同时体型较小的动物是理想的AD 候选动物模型。通过全基因组测序和分子基础研究证实，攀鼩目动物树鼩为灵长目的近亲[9]，具有较大的脑重比和复杂的行为特征，适合应用于神经退行性疾病研究[10-11]。与非人灵长类动物相比，树鼩体型小，成年体重平均150 g 左右，饲养的空间和经济成本低，繁殖周期短[12]。有研究已经证实，通过将孵育的Aβ1-40注射到大脑，引起树鼩认知功能障碍[13]并且临床治疗药物多奈哌齐可缓解树鼩症状[5]。D-半乳糖是一种动物体内的还原糖，皮下注射可以模拟自然衰老过程并诱导行为改变[14]，同时还可促进认知功能障碍、神经元损伤、线粒体功能丧失和胆碱能系统异常[15-16]。但尚未见复合因素诱导树鼩AD 模型的报道。

AD 动物模型包括单因素诱导和复合因素诱导。复合因素AD 动物模型是使用2 种或者2 种以上的因子联合作用，以更全面地模拟AD 的病理改变。AD 复合模型的构建通常使用2 种诱导方法，一种为短暂性、局部性的诱导因子，常采用脑内注射Aβ[17]、链脲霉素等；另一种诱导方式通常为相对长期性、机体整体性的作用，与AD 时程长、病情严重的特点相符合，例如D-半乳糖注射衰老模型、高胆固醇饮食模型、丙烯醛诱导模型、金属离子紊乱模型[18]。AD 复合模型的优点是能研究多种因素在AD 发展中的作用以及因素间的相互作用关系。Morimoto 等[19]在大鼠脑内注射β 淀粉样蛋白25-35 或1-40 片段联合鹅膏蕈氨酸，观察到海马区神经元大量丢失和Aβ 沉积，胶质细胞活化。Laurent 等[20]用β 淀粉样蛋白联合2 价铁离子导致氧化应激反应，淀粉样蛋白沉积和神经细胞凋亡增加、记忆能力降低。

在AD 病理学中，认知功能障碍是典型的行为学变化[21-22]。脑内Aβ1-42是构成老年斑的核心病理学分子[23-24]。本实验以雄性树鼩为研究对象，通过海马内注射Aβ25-35、皮下注射D-gal 和联合给药三种方式，发现D-半乳糖、Aβ25-35和D+A 组树鼩均出现认知功能损伤，观察到大脑皮层和海马中Aβ1-42蛋白的表达增加。表明D-半乳糖、Aβ25-35单独和联合作用均能诱导树鼩AD 样病理改变。相对于单因子诱导，D-半乳糖和Aβ25-35复合因素诱导，树鼩认知障碍和分子病理学特征更显著，是更为合适的树鼩AD 造模方式，本实验进一步优化和丰富了树鼩AD 模型。