CRIF1对棕榈酸诱导心肌细胞凋亡的作用及机制*

冯 娟， 侯娟妮， 冯 健， 唐名扬， 宋志平， 陈 莎， 裴海峰△， 杨永健, △

[1陆军军医大学(第三军医大学)研究生院， 重庆 400038； 2西部战区总医院心内科， 四川 成都 610083]

脂毒性心肌病是指心肌细胞对脂肪酸(fatty acids，FAs)的摄取、代谢和氧化失衡导致毒性脂代谢产物积聚，造成心肌细胞结构和功能受损、心脏功能障碍和心力衰竭等[1]。CR6相互作用因子1(CR6-interacting factor 1，CRIF1)是一种多功能蛋白，表达于细胞核和胞质中，在细胞核中发现具有调控细胞周期和肿瘤发展的作用[2]，并与多种转录因子相互作用[3]；它还是线粒体DNA编码氧化磷酸化(oxidative phosphorylation，OXPHOS)亚基重要的有丝分裂核糖体蛋白，CRIF1缺失会影响OXPHOS复合物的正常形成，导致线粒体功能降低[4]。有研究表明，CRIF1缺失导致进行性心脏肥大、心力衰竭，甚至死亡[5]。CRIF1是影响心肌细胞线粒体的结构和功能重要分子，而线粒体又是细胞内脂肪酸β氧化的重要场所，因此，CRIF1可能与脂肪酸的代谢及脂毒性心肌病的发生发展有着密切联系。目前， CRIF1在脂毒性心肌病中的作用及机制尚无研究报道。本研究采用棕榈酸(palmitic acid, PA)模拟高脂环境诱导心肌细胞凋亡，建立脂毒性心肌病细胞模型，研究CRIF1对高脂诱导心肌细胞凋亡的作用及机制，旨在为脂毒性心肌病提供新的治疗靶点。

材 料 和 方 法

1 细胞株

小鼠心肌细胞系(mouse cardiomyocytes，MCMs)购于深圳豪地华拓公司, 产品批号：HTX2799。

2 主要试剂

DMEM培养基及胰蛋白酶(HyClone)；胎牛血清(Gibco)；棕榈酸(Sigma)；Trizol、SYBR及逆转录试剂盒(TaKaRa)；RT-qPCR引物(成都擎科梓熙生物公司)；Lipofectamine 2000、Scra siRNA及CRIF1 siRNA(广州锐博公司)；抗α-横纹肌肌动蛋白(α-sarcomeric actin)抗体(武汉博士德公司)；抗CRIF1抗体(Omnimabs)；抗β-actin抗体及山羊抗兔 II 抗(上海优宁维公司)；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(BD)；测定小鼠活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的ELISA试剂盒(ELIXIR)；超氧化物阴离子荧光探针二氢乙啶(dihydroethidium，DHE)和N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)购自上海碧云天公司。

3 主要方法

3.1细胞培养及分组 小鼠心肌细胞培养于含有10%胎牛血清、1%双抗的DMEM正常葡萄糖培养基(葡萄糖5.5 mmol/L)中，置于37 ℃、5% CO2培养箱。根据前期预实验选择最佳棕榈酸干预浓度为300 μmol/L模拟高脂环境，建立细胞脂毒性模型，干预时间24 h。首先将MCMs分为对照(control)组和PA (300 μmol/L)组。为探索CRIF1对棕榈酸诱导MCMs损伤的影响及机制，利用siRNA转染敲减细胞CRIF1的表达，进一步将PA组分为溶剂组(vehicle，转染试剂)、非特异阴性siRNA组(Scra siRNA，转染试剂+非特异阴性siRNA)和CRIF1特异性siRNA组(CRIF1 siRNA，转染试剂+CRIF1特异性siRNA)。为进一步验证CRIF1在棕榈酸导致MCMs损伤的具体机制，利用siRNA敲减CRIF1的表达，再将细胞分为DMSO组和NAC组，并给予相同条件的棕榈酸干预。

3.2RT-qPCR检测CRIF1的mRNA表达 采用TRIzol法提取细胞总RNA，测定RNA浓度，逆转录为cDNA，以β-actin为内参照，采用RT-qPCR法测量CRIF1的mRNA表达量。用基因相对定量法(2-ΔΔCt)计算目的基因表达量。β-actin的上游引物序列为5’-ACCCCGTGCTGCTGACCGAG-3’，下游引物序列为5’-TCCCGGCCAGCCAGGTCCA-3’；CRIF1的上游引物序列为5’-ACGAATTGCTGCTATGGCCT-3’，下游引物序列为 5’-CATGGCCTAGTGTCCAGGTG -3’。

3.3Western blot 检测CRIF1蛋白表达 配制分离胶和浓缩胶，取10 μL样品行SDS-PAGE分离，然后转至PVDF膜上，于5%脱脂牛奶中室温封闭2 h。用抗CRIF1(1∶500)和β-actin(1∶5 000)的 I 抗4 ℃孵育过夜。TBST漂洗3次，II 抗(山羊抗兔，1∶8 000)室温孵育1 h后，TBST漂洗3次,每次10 min(在摇床上进行)，最后使用ECL化学发光液进行发光，并使用ImageJ软件分析灰度值。

3.4细胞免疫荧光染色 细胞干预完成后吸去培养基，用PBS冲洗3次,每次5 min。以4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS冲洗(3次)。0.2% Triton X-100透化2～5 min，PBS冲洗。5 % BSA室温封闭30 min，PBS冲洗。加入抗CRIF1抗体(1∶100)4 ℃过夜，PBS冲洗。加入荧光 II 抗，37 ℃避光孵育30 min，PBS冲洗。DAPI以1:500浓度滴于激光共聚焦皿，室温孵育5 min，PBS冲洗。保持湿润，激光共聚焦显微镜下观察。

3.5CRIF1 siRNA的转染 提前 1 d 将MCMs接种到6孔板中，待细胞密度到30%～50%时，使用Lipofectamine 2000转染siRNA，转染浓度为50 nmol/L，每组设3个复孔。Control组仅给予Lipofectamine 2000处理，Scra siRNA组给予Lipofectamine 2000+Scra siRNA处理，CRIF1 siRNA组给予Lipofectamine 2000+CRIF1 siRNA处理。转染48 h后检测CRIF1的mRNA表达水平，72 h后检测CRIF1蛋白表达以明确敲减效率。转染48 h后给予300 μmol/L棕榈酸继续干预24 h并检测细胞的ROS和凋亡水平。

3.6流式细胞术检测MCMs的凋亡水平 用0.25%不含EDTA的胰酶消化离心收集细胞，用预冷PBS洗涤后binding buffer重悬细胞，加入annexin V-FITC(2.5 μL)混匀后，室温避光孵育15 min，流式细胞术检测前5 min再加入PI染液(2.5 μL)，使用流式细胞仪检测细胞凋亡，FlowJo软件分析数据。

3.7DHE染色观察MCMs中ROS的生成 将DHE荧光探针按5 μmol/L浓度用培养基稀释后加入到各组细胞培养基中，每个实验组设置3个复孔，37 ℃避光孵育30 min，采用激光共聚焦显微镜观察DHE荧光水平。

3.8ELISA试剂盒测定MCMs细胞内ROS的含量 加入裂解液破坏细胞，4 ℃ 2500 r/min离心30 min取上清液，按试剂盒说明书操作，测量吸光度，计算ROS含量。

4 统计学处理

采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，两组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 高脂促进MCMs中CRIF1的表达

经免疫荧光染色鉴定MCMs,见图1。采用300 μmol/L棕榈酸对MCMs干预24 h后，通过RT-qPCR及Western blot法分别检测，结果发现CRIF1的mRNA和蛋白表达水平均明显升高(P<0.05)，见图2A、B。通过细胞免疫荧光染色检测发现CRIF1的表达水平明显升高，见图2C。这提示CRIF1不但在MCMs有表达，而且棕榈酸可导致其表达增多。该结果表明CRIF1可能在高脂所致的MCMs损伤中发挥了一定作用。

2 CRIF1沉默加重高脂条件下的MCMs凋亡

为验证CRIF1是否在高脂诱导的MCMs凋亡中发挥了重要作用，本实验采用特异性siRNA敲减CRIF1的表达后继续予以棕榈酸干预。转染后CRIF1的mRNA及蛋白表达水平均明显降低(P<0.05)，见图3A、B。通过流式细胞术检测发现棕榈酸能够导致MCMs凋亡增加(P<0.05)；而CRIF1沉默进一步增加了MCMs凋亡(P<0.05)，见图3C。该结果表明CRIF1可能是高脂环境下受损MCMs重要的保护性分子。

Figure 1.The identification of cardiomyocytes. The protein expression of α-sarcomeric actin detected by immunofluorescence staining (blue indicates DAPI; red indicates α-sarcomeric actin; ×200).

图1 心肌细胞鉴定

3 CRIF1沉默诱发心肌脂毒性损伤时增加ROS的生成

为进一步明确CRIF1沉默是否通过氧化应激途径加重高脂条件下的心肌脂毒性损伤，在敲减CRIF1表达的基础上予以棕榈酸干预24 h后，DHE染色和ELISA检测结果显示，棕榈酸能够增加细胞内ROS 的生成(P<0.05)；而CRIF1沉默后细胞内ROS 的生成进一步增加(P<0.05)，见图4。这一结果表明CRIF1的确通过抑制ROS的产生发挥高脂条件下的心肌保护作用。

4 NAC部分逆转CRIF1下调造成的心肌脂毒性损伤

同样转染CRIF1 siRNA的细胞，用抗氧化剂NAC(5 mmol/L)干预6 h后，ELISA及流式细胞术检测结果显示，MCMs中ROS及细胞凋亡水平明显降低(P<0.05)，见图5。这表明CRIF1作用的发挥与氧化应激反应显著相关。

讨 论

近年来，由于人们饮食习惯和生活方式的改变，肥胖的发病率正在逐年增加，肥胖相关的心功能障碍也在逐年升高，这可能与脂毒性心肌病的发生密切相关[6]。心脏能量代谢的60%～80%依赖于脂肪酸的氧化，当心肌细胞对脂质的摄取和氧化失衡时，毒性的脂肪代谢产物(如神经酰胺、二酰甘油和长链酰基辅酶A等)可在心肌细胞中积聚引起线粒体功能障碍、能量生成减少和内质网应激等，最终可导致心肌细胞凋亡、心功能障碍和心力衰竭等严重后果，这一过程称为脂毒性心肌病[7]。2型糖尿病、肥胖、心肌缺血和心力衰竭等疾病均可引起脂毒性心肌病的发生[8]。2型糖尿病及肥胖患者的血脂异常可导致心脏脂质积累[9]，而循环中高游离脂肪酸(free fatty acids， FFAs)水平与心肌脂毒性密切相关[10]，可引起心肌肥厚、纤维化和心肌细胞凋亡等[11]。本研究也证实了棕榈酸能够诱导心肌细胞凋亡，但其潜在的机制尚不清楚。因此，深入研究脂毒性心肌病的损伤机制和干预靶点非常有意义。

Figure 2.The effect of palmitic acid (PA) on CRIF1 expression at mRNA and protein levels in the MCMs. A: the mRNA expression of CRIF1 detected by RT-qPCR; B: the protein expression of CRIF1 detected by Western blot; C: the protein expression of CRIF1 detected by immunofluorescence staining (blue indicates DAPI; green indicates CRIF1; ×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

图2 棕榈酸对MCMs CRIF1表达的影响

线粒体对能量稳态的维持至关重要,其氧化磷酸化系统在细胞能量和自由基的产生中发挥重要作用[12]。线粒体氧化磷酸化系统由嵌入线粒体内膜的5个OXPHOS多聚体复合物组成；而CRIF1是OXPHOS亚基生成所必需的核糖体因子，在维持线粒体的结构和功能中占据举足轻重的地位[4]。CRIF1是一种具有多种生物学功能的蛋白，在细胞核和线粒体中均有表达，最初被认为是调节细胞周期和生长的分子[13]，可与多种核受体交互作用[14]。在小鼠心肌细胞中，CRIF1的缺失可引起线粒体结构异常和心肌ATP产量降低，表明CRIF1可能在维持心肌线粒体结构和功能中发挥关键作用[5]。然而，CRIF1在脂毒性心肌损伤中的表达以及功能研究尚无报道。我们的研究发现，CRIF1表达于MCMs中，且在棕榈酸干预后明显上升，提示CRIF1可能在脂毒性心肌损伤中发挥着重要作用。在脂毒性心肌病细胞模型中CRIF1表达的增加，可能是细胞内的一种代偿性自我保护机制。为了进一步阐明CRIF1在其中的作用，我们给予特异性siRNA敲减CRIF1的表达，结果发现， CRIF1下调会进一步增加MCMs凋亡，即CRIF1下调会加重脂毒性心肌损伤。CRIF1可能在脂毒性心肌损伤中发挥重要保护作用，但其通过何种途径调控细胞凋亡需要进一步研究。

ROS是细胞代谢和稳态维持的重要副产物，线粒体是产生ROS主要场所之一，当细胞中ROS的产生过多，超过抗氧化系统对其清除的能力，可对机体产生有害的氧化应激损伤[15-16]。氧化应激可导致线粒体损伤[17]，而线粒体损伤又进一步增加ROS的生成[18]，两者形成不断加剧的恶性循环。大量人体和动物研究均表明，氧化应激参与了脂质超载的反应，氧化应激水平随着脂质的积累而不断增加[19]。循环中过高的脂质水平可通过影响心脏线粒体功能导致心肌损伤[8]，线粒体氧化应激在代谢综合征患者心肌细胞凋亡的发病机制中起主要作用[20]，而心肌细胞凋亡是影响心脏结构和功能的重要因素[21]。这些研究均表明，氧化应激可能介导了脂毒性心肌损伤发生，我们的研究也证明氧化应激可能介导脂毒性心肌损伤，而线粒体CRIF1是否参与其中呢?在骨髓多能间充质细胞中发现，CRIF1可减轻辐射损伤后的氧化应激水平[22]；在内皮细胞中发现，敲减CRIF1的表达可增加ROS生成[23]。这些报道均提示CRIF1可能通过抑制氧化应激发挥细胞保护作用。为了明确CRIF1在脂毒性心肌病中的相关保护机制，我们在敲减CRIF1后检测了细胞内氧化应激水平，发现MCMs中ROS的水平显著增加，提示细胞内ROS含量增加可能是CRIF1下调加重MCMs凋亡的内在机制。为了明确这一结论，本研究给予细胞抗氧化剂NAC干预，结果发现，NAC可降低细胞ROS水平，减少CRIF1下调诱导的细胞凋亡,进一步证实了上述结论：CRIF1对MCMs的保护作用可能是通过抑制细胞内的氧化应激实现的。

Figure 3.The effects ofCRIF1knock-down on apoptosis of PA-treated MCMs. A: RT-qPCR; B: Western blot; C: flow cytometry; Mean±SD.n=5.ΦP<0.05vscontrol group;&P<0.05vsvehicle/PA group;$P<0.05vsScra siRNA/PA group.

图3 敲减CRIF1的表达对棕榈酸诱导MCMs凋亡的影响

Figure 4.The effects ofCRIF1knock-down on ROS level in PA-treated MCMs. A: DHE staining (×200); B: ELISA. Mean±SD.n=4.ΦP<0.05vscontrol group;&P<0.05vsvehicle/PA group;$P<0.05vsScra siRNA/PA group.

图4 敲减CRIF1的表达对棕榈酸诱导MCMs生成ROS的影响

Figure 5.NAC attenuated the PA-treated MCM damage enhanced byCRIF1knock-down. A: ROS level detected by ELISA; B: apoptosis detected by flow cytometry. Mean±SD.n=5.#P<0.05vsDMSO group.

图5 NAC减轻敲减CRIF1表达加重棕榈酸诱导所致MCMs损伤的作用

本实验检测了脂毒性心肌病状态下细胞内总CRIF1的变化情况，但其在不同细胞器中表达的有无变化尚不清楚，其抑制ROS产生具体机制仍需进一步探索，后续实验中我们将采用腺病毒过表达技术进一步探索CRIF1与氧化应激之间的关系。综上所述，在脂毒性心肌病中，CRIF1可能通过抑制氧化应激反应来发挥心肌保护作用。这为CRIF1在脂毒性心肌病中的作用提供了理论基础，有利于开发新的防治靶点。