高效液相色谱串联质谱法测定禽蛋中异丙嗪和氯丙嗪

王可*，曹倩玉，赵灵芝，陈龙星，高倩，杨莉丽

1. 石家庄市疾病预防控制中心毒物检测中心（石家庄 050011）；2. 河北师范大学化学与材料科学学院（石家庄 050024）

氯丙嗪是一个直接作用于中枢神经细胞的镇静剂，有中枢抑制作用，可用于治疗躁狂症、精神分裂症等。异丙嗪有较强的中枢安定和抗过敏作用，可以起到镇静、麻醉和止痛的效果。氯丙嗪和异丙嗪混合可制成安定类药物，能降低中枢神经系统多巴胺活性[1]。一些养殖户在饲料和水中添加此类药物来抑制动物运动，从而间接起到催肥促进生长作用[2]；在动物运输过程中使用，减少动物运输途中失重、降低死亡率[3-4]。这类药物在体内代谢缓慢，容易产生体内蓄积残留，不仅可引起动物中毒，还有可能通过食物残留进入人体，长期蓄积并引发人体肾脏和肝脏的病变而危及生命[5]。因此，世界各国对于动物源食品中镇静剂类药物的残留均有严格限量要求，欧盟早在1997年就将氯丙嗪列入禁用清单中，中国于2002年规定氯丙嗪禁止用于食源性动物[6-7]。该类药物的检测研究对象主要是饲料、猪肝、猪肉、血液、生物组织、尿液等[8-12]，关于动物源食品禽蛋中异丙嗪和氯丙嗪的检测方法未见报道。因此，建立禽蛋中异丙嗪和氯丙嗪的快速检测方法具有重要意义。

对于异丙嗪和氯丙嗪的检测方法主要包括液相色谱法[13]、气相色谱法[14]、化学发光法[15]、光谱法[16]、电化学分析法[17]、高效液相色谱串联质谱法[18]等。其中，液相色谱法以保留时间定性，容易出现假阳性结果，且灵敏度不高。化学发光法需柱后衍生，操作过程繁杂。HPLC-MS/MS具有高通量和高灵敏度的特点，分析时间短，可信度高，尤其是对复杂基质样品中痕量物质的残留检测有着明显优势。试验基于HPLC-MS/MS建立禽蛋中异丙嗪和氯丙嗪的分析方法，并对色谱条件、前处理方法等进行优化。该方法操作简单、准确度高、精密度好，适用于禽蛋中异丙嗪和氯丙嗪的快速定量分析。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1200-6410B液相色谱串联质谱仪（美国Agilent公司）；AE 240型电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；T-460/H型超声清洗器（德国Elma公司）；C3I型台式离心机（法国Jouan公司）；EVAP-Ⅲ型氮吹仪（美国Organomation）；MS3型涡旋振荡器（德国IKA公司）；Milli-Q型超纯水机（美国Millipore公司）。

乙腈、甲酸、甲醇（均为色谱纯，美国Fisher公司）；乙二胺-N-丙基甲硅烷（PSA）填料（美国Supelco公司）；C18填料（美国Welch公司）；Oasis MCX固相萃取柱（美国Waters公司）；ProElut PLS固相萃取柱（美国Dikma）；C18固相萃取柱（美国Welch公司）；盐酸异丙嗪（C17H20N2S·HCl，中国药品生物制品鉴定所）；盐酸氯丙嗪（C17H19ClN2S·HCl，Dr. Ehrenstorfer GmbH）。

1.2 混合标准系列溶液的配制

分别准确称取适量氯丙嗪和异丙嗪标准品，用乙腈配制成质量浓度为1.0 mg/mL的标准储备液，于-20℃保存。取适量各标准储备液，用乙腈稀释得到1.0 μg/mL的混合标准液。采用空白基质提取液稀释，配制0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0和100.0 ng/mL的系列混合标准工作溶液。

1.3 样品前处理

取一枚禽蛋，去壳后搅拌均匀，准确称取约2 g（精确到0.01 g）样品于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈，涡旋混匀30 s，超声15 min，以4 000 r/min离心5 min，移取提取液，再次加10 mL乙腈，进行二次提取，合并两次提取液并加入0.3 g NaCl涡旋混匀，静置10 min；取12 mL上清液用0.03 g PSA和0.10 g无水硫酸镁（MgSO4）进行净化，充分混合后以4 000 r/min离心5 min，取10 mL净化液在40 ℃下氮吹至干，用1 mL乙腈复溶，经0.2 μm滤膜过滤后，供HPLC-MS/MS检测。

1.4 色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×50 mm，1.8 μm，美国Agilent公司）；柱温35 ℃；流动相，0.1%甲酸水-乙腈（35︰65，V/V）；进样量5 μL；流速0.2 mL/min。

1.5 质谱条件

电喷雾离子源（ESI），正离子模式；雾化气（氮气）压力30 psi；干燥气温度350 ℃；干燥气流速10 L/min；毛细管压力4 000 V；监测方式为多反应监测（MRM）。异丙嗪和氯丙嗪的母离子、碎裂电压、子离子和碰撞能等质谱参数见表1。

表1 异丙嗪和氯丙嗪的质谱参数

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

在离子化过程中，异丙嗪和氯丙嗪易结合H+，形成[M+H]+，故在水相中加入0.1%甲酸，以提高其质子化效率。液相色谱中常用的流动相为乙腈或甲醇。试验针对有机相甲醇和乙腈进行比较，发现采用乙腈为有机相时，异丙嗪和氯丙嗪的峰型较好，且响应值较高。故而选取0.1%甲酸水-乙腈为流动相，并对流动相比例进行优化，当流动相比例为0.1%甲酸水-乙腈（35︰65，V/V）时，分离效果及峰型较好（图1）。

2.2 前处理条件的优化

2.2.1 提取剂的比较

比较乙腈、乙酸乙酯作为提取剂时异丙嗪和氯丙嗪的加标回收率。试验结果显示，乙腈作为提取剂时，异丙嗪和氯丙嗪的回收率最高，分别为86.3%和71.8%；比较向乙腈中加入氢氧化钠溶液进行提取，结果发现2种镇静剂的回收率整体变差。因此，最终选定提取剂为乙腈。

2.2.2 净化方式的选择

分别比较采用固相萃取柱和分散固相萃取剂净化对异丙嗪和氯丙嗪回收率的影响。如表2所示，采用PLS、C18、MCX固相萃取柱净化时，异丙嗪和氯丙嗪的回收率较低，为32.9%～64.4%；使用分散固相萃取剂PSA与无水MgSO4进行净化时，异丙嗪和氯丙嗪的回收率分别为88.1%和78.7%，回收率较好。进一步对PSA与无水MgSO4的用量进行优化，最终选择采用0.03 g PSA与0.1 g无水MgSO4进行净化。

图1 异丙嗪和氯丙嗪的色谱图

表2 不同净化方式对异丙嗪和氯丙嗪回收率的影响

2.2.3 基质效应的考察

基质效应（ME）指样品中除目标分析物以外的其他成分对待测物测定值的影响，使响应信号增大的为基质增强效应，使响应信号减小的称为基质抑制效应。试验采用同一浓度待测物在基质液与纯溶剂中响应的比值评价基质效应，比值越接近于100%，基质效应越小。比值80%～120%时，表明基质效应较小，可忽略；比值低于80%或高于120%时，表明有较强的基质抑制或增强作用，需用基质匹配标准溶液进行校正[19]。试验得到异丙嗪和氯丙嗪在10.0，20.0，50.0和100.0 ng/mL质量浓度下的基质效为52.8%～71.9%（表3），说明这2种物质都存在较大程度基质抑制效应。为减小基质效应影响，需选用基质匹配标准溶液进行定量分析。

2.3 标准曲线与检出限

以浓度（x）作为横坐标，目标化合物峰面积（y）作为纵坐标，得到相应的标准工作曲线。在0.5～100.0 ng/mL范围内，异丙嗪和氯丙嗪的线性关系良好，相关系数（r2）＞0.999。平行测定11个空白禽蛋样品，分别计算得出2种镇静剂的检出限（LOD，S/N=3）和定量限（LOQ，S/N=10），如表4所示。

表3 异丙嗪和氯丙嗪在禽蛋中的基质效应

表4 异丙嗪和氯丙嗪的线性范围、线性方程、相关系数、检出限与定量限

2.4 方法的回收率与精密度

取禽蛋空白样品，加标浓度分别为10.0，20.0和100.0 μg/kg，每个加标水平平行测定7次，计算异丙嗪和氯丙嗪的加标回收率和相对标准偏差（RSD）。由表5可知，该方法的平均回收率为80.2%～102.0%，RSD为2.5%～8.1%，准确度与精密度较好，能满足禽蛋中异丙嗪和氯丙嗪含量的定量分析要求。

表5 异丙嗪和氯丙嗪的加标回收率与相对标准偏差（n=7）

2.5 实际样品的检测

采用该方法对购自石家庄市不同超市、农贸市场的10份鸡蛋和10份鸭蛋样品进行检测，样品所测结果均低于检出限。

3 结论

以超声辅助提取，分散固相萃取净化，建立高效液相色谱串联质谱对禽蛋中异丙嗪和氯丙嗪同时检测的方法。该方法具有前处理步骤简单、分析时间短、灵敏度高、准确度和精密度好等优点，可应用于禽蛋中异丙嗪和氯丙嗪的快速测定。