四川洪坝乡红景天HPLC指纹图谱研究

孙云波 沈硕 张创峰

[摘要] 目的 建立红景天的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，为其质量标准制订提供依据，同时对不同批次红景天的质量进行研究。 方法 采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法，以Waters Xbridge？誖 Shield RP18（5 μm，4.6 mm×250 mm）為色谱柱、乙腈-0.1%冰醋酸为流动相进行梯度洗脱，检测波长为276 nm，柱温为30℃，进样体积为10 μL，记录时间为70 min。 结果 HPLC指纹图谱的方法学考察符合相关要求，共标定红景天药材HPLC指纹图谱的17个共有峰，指认其中红景天苷、没食子酸、咖啡酸、酪醇、对香豆酸、原儿茶酸、儿茶酸、香草醛、异槲皮苷、槲皮苷、大黄酚-8-O-葡萄糖苷和山奈酚12个特征峰，13批红景天药材指纹图谱的相似度在0.863～0.984。 结论 所建立的红景天HPLC指纹图谱可为红景天质量标准的建立提供依据。

[关键词] 红景天;高效液相色谱指纹图谱;红景天苷;相似度;质量标准

[中图分类号] R927.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）02（a）-0023-05

[Abstract] Objective To establish high performance liquid chromatography （HPLC） fingerprint of Herba Rhodiolae， and to provide the basis for the establishment of quality standards， and at the same time， to study the quality of different batches of Herba Rhodiolae. Methods RP-HPLC method was used. Waters Xbridge？誖 Shield RP18 （5 μm， 4.6 mm×250 mm） wan used as the column， acetonitrile-water containing 0.1% acetic acid was used as the mobile phase of the gradient elute， with the detection wavelength of 276 nm and the colomn temperature maintained at 30℃. The flow rate was 1.0 mL/min. The recording time was 70 min. Results The HPLC fingerprint method validation met the technical standards. A total of 17 common peaks of Herba Rhodiolae. were found. A total of 12 characteristic peak were identified. They were salidroside， callic acid， caffeic aci， tyrosol， p-coumaric acid， protocatechuic acid， catechin， vanillin， isoquercitrin， quercitrin， chrysophanol 8-O-β-D-glucoside， kaempferol， respectively. The similarity of 13 differernt batches of Herba Rhodiolae. was among 0.863-0.984. Conclusion The specific HPLC fingerprint can be used as a method of scientific evaluation for Herba Rhodiolae. crenulata.

[Key words] Herba Rhodiolae; High performance liquid chromatography figerprint chromatograms; Salidroside; Similarity; Quality standard

红景天为景天科大花红景天Rhodiola crenulata（Hook.f.et Thoms.）H. Ohba的干燥根和根茎[1]。其味甘、苦，性平，归肺、心经[2]。常用于控制高原反应，治疗神经系统疾病和消除疲劳[3-4]。红景天还具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和激活磷酸酰肌醇激酶/丝氨酸激酶信号转导等多种药理的作用[4-13];红景天的化学成分较为复杂，主要为多糖类、甾醇类、鞣酸类和黄酮等[14-16]，它们共同构成了红景天的药效物质基础。目前，通常以红景天苷（含量不得少于0.50%）作为其质量控制的唯一标示性成分[1]。然而由于中药材成分的复杂性，单一成分不足以全面反映红景天的内在质量;指纹图谱技术是从药材的整体物质基础角度出发，系统把握药材质量的一种分析技术手段，为药材质量的有效把控提供了一种可靠的质控方法[17-27]。本研究采用高效液相色谱（HPLC）法对红景天药材质量进行了研究，建立了红景天的指纹图谱，为公司顺利通过连花清瘟胶囊美国食品和药物管理局（FDA）二期临床提供更可靠的原药材质量支持，同时为提高红景天药材质量标准奠定基础。

1 仪器与试药

Waters e2695型高效液相色谱仪（PDA检测器，柱温箱，自动进样器;Empower Pro色谱工作站）（美国Waters）;AL204型万分之一及AB135-S型十万分之一电子天平（梅特勒托利多仪器有限公司）;KQ-500DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）;色谱柱Waters Xbridge？誖 Shield RP18（5 μm，4.6 mm×250 mm） （美国Waters）;DL-5200B-Ⅱ型低速大容量多管离心机离心半径为19.6 cm（上海安亭科学仪器厂）;Milli-Q超纯水处理系统（美国密理博公司）;0.45 μm微孔滤膜（天津市津腾实验设备有限公司）。

红景天苷（批号：1001210553，美国sigma）;没食子酸（批号：1110831-201605，中国食品药品检定研究院）;酪醇（批号：111676-200602，中国药品生物制品检定所）;咖啡酸（批号：1001098874，美国sigma）;对香豆酸（批号：112037-201801，中国食品药品检定研究院）;原儿茶酸（批号：809-200102，中国药品生物制品检定所）;儿茶酸（批号：13051511，成都生物化工有限公司）;香草醛（批号：20180712，天津市光复精细化工研究所）;异槲皮苷（批号：111809-201403，中国食品药品检定研究院）;槲皮苷（批号：111538-200504，中国药品生物制品检定所）;大黄酚-8-O-葡萄糖苷（批号：B20239，上海源叶生物科技有限公司）;山奈酚（批号：1354900，USP 12601 Twinbrook Pkwy，Rockville， MD.）;甲醇（色谱纯，美国Fisher）;乙腈（色谱纯，美国Fisher），其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

红景天药材经石家庄以岭药业股份有限公司中药资源部崔旭盛高级工程师鉴定为大花紅景天Rhodiola crenulata（Hook.f.et Thoms.）H. Ohba。药材来源见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Waters Xbridge？誖Shield RP18（5 μm，4.6 mm×250 mm）;流动相为乙腈（A）-0.1%冰醋酸（B）;梯度洗脱见表2;柱温：30℃;检测波长为276  nm;进样量10 μL。

2.2 供试品溶液的制备

称定红景天粉末（过三号筛）约1 g，精密加入75%甲醇20 mL于50 mL具塞锥形瓶中，称定重量，超声提取（功率500 W，频率40 kHz）15 min，再称定重量，用75%甲醇补足减失的重量，摇匀，3500 r/min离心5 min，取上清液0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 对照品溶液制备

精密称定各对照品适量，置具塞容量瓶中，加75%甲醇溶解，超声5 min并制成每1 mL 75%甲醇中含红景天苷、酪醇、儿茶素、大黄酚-8-O-葡萄糖苷对照品约0.50 mg，香草醛、对香豆酸、异槲皮苷、槲皮苷、山奈酚对照品约1.00 mg，没食子酸、原儿茶酸、咖啡酸约1.50 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验  取供试品溶液R8，连续进样6次，各色谱峰的相对（2号红景天苷）保留时间的RSD均<0.26%，相对峰面积的RSD均<4.35%，所得的色谱图的相似度分别为0.998、0.999、0.999、0.999、0.999、0.998，RSD为0.06%，仪器的精密度良好。

2.4.2 稳定性试验  取供试品溶液R8，分别在0、2、4、6、8、10、12、24 h进样测定，各共有有色谱峰的相对（2号红景天苷）保留时间的RSD均<0.34%，相对峰面积的RSD均<5.55%，所得的色谱图的16个共有峰的相似度分别为0.997、0.999、0.999、0.999、0.995、0.996、1.000、 0.997，RSD为0.18%，供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.3 重复性试验  取样品R8，平行制备6份供试品溶液，测定，各共有色谱峰的相对（2号红景天苷）保留时间的RSD均<0.34%，相对面积的RSD均<2.17%，所得的色谱图的相似度分别为0.999、0.999、0.999、 1.000、1.000、0.998，RSD为0.08%，本方法重复性良好。

2.5 指纹图谱的建立

13个不同批次的红景天HPLC检测结果显示，共有近30个共有峰，见图1。选取分离度较好、响应值较高的共有峰中17个色谱峰作为评价红景天药材质量的共有峰。

1：没食子酸;2：红景天苷;3：原儿茶酸;4：酪醇;5：儿茶素;6：咖啡酸;7：香草醛;10：对香豆酸;11：异槲皮苷;15：槲皮苷;16：大黄酚-8-O-葡萄糖苷;17：山奈酚

确定17个共有峰后，将对照品溶液色谱峰的保留时间与供试品溶液色谱峰的保留时间及紫外吸收光谱图进行比对（图1）。被鉴定的供试品溶液中12个色谱峰的紫外图谱（图2），其中以峰面积较大，出峰稳定的2号色谱峰红景天苷为参照峰，采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012. 130723版）进行相似度评价并建立共有模式，生成不同批次红景天药材样品叠加图谱及对照图谱（图3），将生成的对照图谱（R）的相似度值定为1，计算各批红景天药材样品指纹图谱的相似度，结果显示其相似度为0.863～0.984。见表3。

2.6 指纹图谱分析

由匹配结果可知，13批红景天药材相似度较好，指纹图谱含有17个共有峰，以2号红景天苷为参照峰（S），计算各共有峰与S峰的相对保留时间，17个共有峰相对保留时间平均值见表4。将相对保留时间的平均值作为规定值，13批红景天指纹图谱17个共有峰相对保留时间均在规定值±5%范围内。

3 讨论

本研究采用二极管阵列（PDA）检测器在全波长范围内进行样品分析，其中276 nm下检测的色谱图中色谱峰最多，峰值较大，且基线也较为平稳。因此确定检测波长为276 nm。

考察了3个品牌的5种不同的色谱柱，考虑到各色谱峰峰形、分离度及色谱柱应用的广泛性，本研究选择Waters Xbridge？誖Shield RP18色谱柱。同时比较了不同流动相及色谱柱柱温对所得的指纹图谱色谱图的影响，结果显示，在柱温30℃时，以乙腈-0.1%冰醋酸为流动相进行梯度洗脱，色谱图中的色谱峰信息容量较大且分离效果最好。将此分离方法的时间延长至2倍（140 min），结果显示，70 min后无其他色谱峰出现，从而确定梯度洗脱时间为70 min。

在提取工艺优化过程中，以不同比例分数的甲醇和乙醇作为溶媒，分别对提取方式和时间进行了考察。结果显示，75%甲醇超声15 min得到的色谱峰信息最佳。因此，采用该方法进行样品的提取。

本研究采用HPLC-PDA法梯度洗脱建立了红景天指纹图谱，同时对色谱条件和供试品溶液的制备方法进行了优化，并进行了方法学考察;其相对保留时间-精密度、重复性、稳定性的RSD均<0.4%。且建立了红景天药材指纹图谱共有模式，为公司顺利通过连花清瘟胶囊FDA二期临床提供更可靠的原药材质量支持，同时为提高红景天药材质量标准奠定基础。

[参考文献]

[1]  国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2015：154-155.

[2]  国家食品药品监督管理总局执业药师资格认证中心.中药专业知识（二）[M].7版.北京：中国医药科技出版社，2015：131.

[3]  周江韬，许磊，陈燕燕，等.红景天属植物的化学成分[J].中国药学：英文版，2014，23（7）：433-445.

[4]  黄钰芳.红景天活性成分及药理作用[J].中醫药临床杂志，2008，20（5）：528-530.

[5]  林晓月，孙新.红景天抗衰老作用机制研究进展[J].中国老年学杂志，2018，38（13）：3299-3300.

[6]  吴秀专，毕晓华，王燕芳，等.红景天苷药理作用研究进展概述[J].中国药师，2018，21（8）：1460-1462，1505.

[7]  孙许涛，柳颖，姜德友，等.红景天药理作用研究进展[J].中医药学报，2017，45（6）：119-122.

[8]  蒲位凌，李文华，白茹玉，等.红景天及其抗炎和抗肿瘤活性成分药理作用研究进展[J].天津中医药，2017，34（12）：856-859.

[9]  杨逸成，吕泰标，梁栋国，等.红景天苷干预疾病的实验研究进展[J].医学综述，2018，24（2）：371-377.

[10]  梁光彬，吴格怡，黎雄斌，等.红景天对OSAHS相关的PAH患者心功能的辅助治疗作用[J].中国现代医生，2018， 56（10）：42-44，49.

[11]  余磊.红景天苷药理作用的研究进展[J].海峡药学，2017， 29（9）：18-21.

[12]  Chen C，Song JB，Chen M，et al. Rhodiola rosea extends lifespan and improves stress tolerance in silkworm，Bombyx mori [J]. Biogerontology，2016，17（2）：373-381.

[13]  Thu OK，Spigset O，Nilsen OG，et al. Effect of commercial Rhodiola rosea on CYP enzyme activity in humans [J]. Eur J Clin Phar，2016，72（3）：295-300.

[14]  吕秀梅，范芳芳，文检，等.HPLC法同时测定3种红景天药材中5种化学成分的含量[J].中国药房，2018，29（18）：2515-2519.

[15]  图荪古丽·托合提，万传星.红景天根茎化学成分的分离与结构鉴定[J].塔里木大学学报，2018，30（3）：33-38.

[16]  郭增军，谭林，徐颖，等.小丛红景天总黄酮抗氧化活性研究[J].中药材，2011，34（1）：104-107.

[17]  谢培山.中药色谱指纹图谱[M].北京：人民卫生出版社，2005.

[18]  许蓉蓉，林华，秦庆芳，等.金嗓子喉片挥发性成分气相色谱-质谱指纹图谱分析[J].医药导报，2018，37（11）：1386-1388.

[19]  刘敏，范蕾，陈桂云，等.降脂舒心合剂HPLC指纹图谱的建立及制剂安全性项目的影响因素检测[J].中国医药导报，2019，16（9）：117-122.

[20]  赵青舟，刘文兰，曹丽.中药复方一贯煎HPLC指纹图谱研究[J].辽宁中医药大学学报，2018，20（12）：51-55.

[21]  Pedan V，Weber C，Do T，et al. HPTLC fingerprint profile analysis of cocoa proanthocyanidins depending on origin and genotype [J]. Food Chemistry，2018，267（30）：277-287.

[22]  Xie RF，Zhao QH，Li ZC，et al. Comparison on HPLC Fingerprints between Fraxini Cortex and Its Eye Drop [J]. Chinese Herbal Med，2013，5（4）：301-306.

[23]  李芸，张立军，戴海蓉，等.高乌头不同溶剂萃取部位HPLC多波长特征图谱研究[J].中药新药与临床药理，2018，29（5）：630-636.

[24]  徐妍，杨华蕊，杨永寿，等.中药特征图谱研究现状及展望[J].世界最新医学信息文摘，2018，18（76）：91-94.

[25]  陈育鹏，赵倩，王贵金，等.连花清瘟胶囊超高效液相指纹图谱研究[J].中国中医药信息杂志，2017，12（24）：77-80.

[26]  孙云波，沈硕，宋联强，等.草麻黄HPLC特征图谱研究[J].中国中医药信息杂志，2018，12（25）：67-70.

[27]  俞洁东，曾海松，吴革林，等.脉络通颗粒HPLC指纹图谱研究[J].中国医药导报，2019，16（4）：39-42.

（收稿日期：2019-08-19  本文编辑：刘永巧）