万寿菊的显微鉴别及5个主要成分的含量测定

吕邵娃 菅计苹 谭美微

[摘要] 目的 通過显微鉴别的方法对万寿菊的根、茎、叶等显微特征进行研究，同时测定不同部位主要成分的含量，为其质量控制及合理有效的开发利用提供理论依据。 方法 采用显微鉴定法观察万寿菊的显微结构特征;采用YMC C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），乙腈（B）-0.1%甲酸水溶液（A）为流动相，梯度洗脱;检测波长为257 nm;柱温为室温;流速为1.0 mL/min;供试品溶液进样量为10 μL。 结果 5，7，3′-三羟基-3，6，4′-三甲氧基黄酮（1）、5，7，4′-三羟基-3，6-二甲氧基黄酮（2）、万寿菊苷（3）、5，3′-二羟基-3，6，4′-三甲氧基-黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷（4）和5-羟甲基糠醛基-甲基-丁二酸酯（5）5种化合物的线性回归方程分别为：Y = 2.7957X-0.1385、Y = 2.7951X-0.1163、Y = 0.1740X-0.0231、Y = 0.9006X-0.1242、Y = 0.1815X-0.0916，相关系数为0.099 92～0.099 95，加样回收率在96.43%～101.17%，RSD在0.13%～1.75%。万寿菊根茎中均有此5个化学成分，且除化合物5外，其余4种化合物在茎中的含量均高于根中。化合物5在万寿菊茎部的含量最高，达2.5%。 结论 本研究首次对万寿菊的根、茎、叶进行有效的显微鉴定及5种重要成分进行含量测定，该方法简便、准确，重复性好，为万寿菊的质量控制提供理论依据。

[关键词] 万寿菊;显微特征;高效液相色谱法;含量测定

[中图分类号] R927.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）02（a）-0004-04

[Abstract] Objective To provide theoretical basis for quality control and rational and effective development and utilization of Tagetes erecta L. by studying the microscopical characteristics of root， stem and leaf of marigold by means of microscopic identification， and detecting the contents of main components in different parts. Methods The microstructure features of Tagetes erecta L. were observed by microscopic identification. YMC C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5 μm） was used as the column， acetonitrile （B） - 0.1% formic acid aqueous solution （A） was used as mobile phase of gradient elution with the detection wavelength of 257 nm and the colomn temperature was room temperature. The flow rate was 1.0 mL/min. The injection volume of the sample was 10 μL. Results 5，7，3′-trihydroxyl-3，6，4′-trimethoxylflavone （1）， syringic acid （2）， patulitrin （3）， 5，3′-dihydroxyl-3，6，4′-trimethoxylflavone-7-O-β-D-glucopyranoside （4）， 5-hydroxymethylfurfuryl methyl succinate （5） five kinds of linear regression equations were： Y = 2.7957X-0.1385， Y = 2.7951X-0.1163， Y = 0.1740X-0.0231， Y = 0.9006X-0.1242， Y = 0.1815X-0.0916. The correlation coefficient of the compounds was 0.099 92-0.099 95， the recovery rate of the sample was 96.43%-101.17%， and the RSD was 0.13%-1.75%. These five chemical components were found in the rhizome of Tagetes erecta L.， and the contents of the other four compounds in the stem were larger than those in the root except for the compound 5. The content of compound 5 was the highest in the stem of Tagetes erecta L.， up to 2.5%. Conclusion In this experiment， the effective microscopic identification of the roots， stems and leaves of marigold and the determination of five important components are carried out for the first time. The method is simple， accurate and reproducible， and provides a theoretical basis for the quality control of Tagetes erecta L..

[Key words] Tagetes erecta L.; Microscopic characteristics; High performance liquid chromatography; Content determination

万寿菊为菊科万寿菊属植物万寿菊Tagetes erecta L.的干燥全草[1-4]，具有平肝清热、祛风化痰之功效。万寿菊其花的主要化学成分为黄酮类及苷类、噻吩类、精油类化合物[5-9]，其花中的叶黄素含量较高，作为提取叶黄素的原料[10-14]。有研究报道指出[15-18]，万寿菊中的黄酮类化合物具有杀虫作用，植物杀虫剂因具有绿色、对环境友好等优点成为近年来研究的热点。本研究对前期从该植物的根部分离鉴定的具有杀虫活性的4个主要的黄酮类成分5，7，3′-三羟基-3，6，4′-三甲氧基黄酮（1）、5，7，4′-三羟基-3，6-二甲氧基黄酮（2）、万寿菊苷（3）、5，3′-二羟基-3，6，4′-三甲氧基-黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷（4）和1个新的糠醛类化合物5-羟甲基糠醛基-甲基-丁二酸酯（5）进行了含量测定研究，并对万寿菊花、茎及根进行了显微鉴定和粉末鉴定，为万寿菊的质量控制及作为植物杀虫剂的合理有效的开发利用提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

显微镜（OLYMPUS）;拍摄软件（OLYMPUS）CM1900;冷冻切片机（Leica）;冷冻液（Leica）;高速粉碎机（欣镇精密企业有限公司）;高效液相色谱法（HPLC）色谱仪（Sanofi）;色谱柱（YMC）;SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）;SB-5200D超声波清洗机（宁波新艺生物科技股份有限公司）。

1.2 试药

万寿菊原药材于2016年6月采自黑龙江省五常市，经李国玉博士鉴定为科植物万寿菊;水合氯醛、甘油、二氯甲烷、三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、无水乙醇、95%乙醇、甲醇、乙腈为色谱纯;5，7，3′-三羟基-3，6，4′-三甲氧基黄酮对照品（成都曼斯特生物科技有限公司，货号：16090710，纯度>98%）;5，7，4′-三羟基-3，6-二甲氧基黄酮对照品（成都曼斯特生物科技有限公司，货号：16040510，纯度>98%）;万寿菊苷对照品（四川省维克奇生物科技有限公司，货号：16032808，纯度>98%）;3′-二羟基-3，6， 4′-三甲氧基-黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷（四川省维克奇生物科技有限公司，货号：16071408，纯度>98%）。进行含量测定的其余试剂均为分析纯。

2 显微鉴别

2.1 方法

万寿菊根和茎样品鲜品部分晒干后进行性状鉴定，拍照。鲜品根、根茎、茎及叶分别用FAA固定液固定，组织特征观察采用石蜡切片法制作永久切片、徒手切片法制作临时切片。根、茎、花粉末特征采用粉末制片法制片，部分用水合氯醛-稀甘油加热透化处理后制作，置于显微镜下观察。

2.2 结果

2.2.1 茎、根横切面  茎的横切面中厚角组织明显，与其茎表面内棱状突起相符，排列整齐，韧皮部较窄，木质部多导管、纤维分布。根的横切面皮层明显，韧皮部较窄，细胞结合紧密，木质部、木射线呈径向分布明显，导管、纤维多见。见图1（封四）。

2.2.2 花粉末  黄色粉末，表皮细胞呈类方形，花粉粒棕黄色球形，表面有纤毛状凸起，可见3个萌发孔，向内凹陷。分泌細胞呈黄色，色素颗粒多见，常附着在花粉粒、表皮碎片、花柱头碎片等碎片组织上，呈橙黄或棕红色。见图2（封四）。

2.2.3 茎粉末  浅绿色粉末，表皮细胞类方形或长方形，壁边缘不规则增厚，长条形纤维，与导管同现，螺纹导管多见，也见孔纹导管。见图2（封四）。

2.2.4 根粉末  黄白色粉末，表皮细胞类方形或长方形，壁边缘不规则增厚，长条形纤维，螺纹导管及纹孔导管多见常伴生。见图2（封四）。

3 HPLC同时测定万寿菊不同部位中5个成分的含量

3.1 色谱条件

色谱柱：YMC C18，流动相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～10 min，10%→20%B;10～14 min，20%→22%B;14～25 min，22%→26%B;25～29 min，26%→28%B;29～39 min，28%→32%B;39～49 min，32%→35%B;49～54 min，35%→38%B;54～64 min，38%→40%B）;检测波长为257 nm;柱温为室温;流速为1.0 mL/min;供试品溶液进样量为10 μL。

3.2 溶液的制备

对照品溶液的制备：分别取化合物1～5适量，精密称定，置于50 mL容量瓶中，色谱甲醇定容至刻度，配制成浓度分别为0.0416、0.0590、0.0483、0.0302、0.0510 mg/mL的混合对照品溶液。

供试品溶液的制备：称取万寿菊干燥根粉末12.0 g，置于500 mL圆底烧瓶中，95%醇回流提取2次，2 h/次，合并过滤液，回收至干，水悬浮用石油醚和乙酸乙酯萃取，回收萃取液至干，适量用DMSO溶解，甲醇定溶于25 mL容量瓶中作为供试品溶液备用。

3.3 系统适应性试验

取“3.1.2”下的混合照品溶液、供试品溶液和空白溶液各适量，按“3.1.1”项下条件进行测定。在该色谱条件下，各待测成分与杂质峰间分离度>1.5，理论塔板数以5，7，3′-三羟基-3，6，4′-三甲氧基黄酮计不低于4000。见图3。

3.4 线性关系考察

分别精密量取“3.1.2”项下混合对照品溶液1、2、5、10、15、20 μL，按“3.1.1”项下色谱条件测定。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果各成分在各自相应范围内线性关系良好。见表1。

3.5 检测限和定量限试验

分别精密量取“3.1.2”项下混合对照品溶液适量，倍比稀释，按“3.1.1”项下色谱条件进行测定，以信噪比为3∶1时的进样量最低检测限为0.5 ng，以信噪比为10∶1时的进样量最低定量限为2.0 ng。

3.6 精密度试验

精密量取“3.1.2”项下混合对照品溶液10 μL，按“3.1.1”项下色谱条件连续进样6次，测得化合物1～5的峰面积的RSD分别为0.41%、0.95%、0.41%、0.99%、0.78%（n = 6），结果仪器的精密度良好，符合测试要求。

3.7 重复性试验

精密称取万寿菊药材粉末0.5 g，按“3.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“3.1.1”项下色谱条件进样 10 μL。结果显示，化合物1～5峰面积的 RSD值分别为0.56%、0.99%、0.78%、0.74%、1.40%（n = 6），方法的重复性良好。

3.8 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于室温条件下放置 0、2、 4、6、8、12 h后，按“3.1.1”项下色谱条件进行测定。结果，化合物1～5峰面积的RSD值分别为0.50%、1.18%、0.82%、1.36%、1.13%（n = 6），样品溶液在室温条件下12 h内的稳定性良好。

3.9 加样回收率试验

精密称取根部粉末0.48 g，分别加入化合物1～5各46.05、14.50、1356.2、36.65、58.60 μg，按“3.1.2”项下方法制备供试品，定容至5 mL，按“3.1.1”项下色谱条件进行测定，计算加样回收率。化合物1～5的平均回收率分别为98.85%、97.80%、99.40%、101.17%、96.43%，RSD值分别为1.04%、0.98%、0.31%、1.75%、1.60%（n = 6）。方法的准确度良好。

3.10 5种成分在万寿菊不同部位的含量

经过考查，本实验选用95%甲醇为提取溶剂、乙腈-0.1%甲酸水作为本研究的流动相系统、检测波长257 nm。5个化合物在万寿菊不同部位的含量结果见表2。

4 讨论

本研究首次对万寿菊进行显微特征鉴别，为万寿菊的质量控制提供理论依据。Uhlenbroek等[19]从万寿菊根中分离出的噻吩类化合物具有杀线虫活性。根据李晓飞等[20]的研究发现万寿菊各部位组织粗提物的杀线活性与万寿菊不同部位中α-三连噻吩的含量基本呈相反的趋势，认为α-三连噻吩可能不是万寿菊的主要杀虫物质。相关研究[21-24]提示黄酮类具有较好的杀虫效果。本研究测得的黄酮类化合物1～4的含量都是茎>根部，而根据郭章碧[25]的研究，杀虫效果根>花>叶>茎，可能产生差异的原因是由于万寿菊各部位中的含量成分复杂，在根中有与黄酮类化合物起到协同促进作用的化合物，致使表现出来根的杀虫效果更好，而化合物3和4在花中含量很少，但可能是成苷后毒性较强，含量较少就可以起到毒杀作用。故推测万寿菊中存在黄酮以外的杀虫成分，化合物5糠醛类物质可能是潜在的杀虫成分，因此万寿菊作为绿色杀虫剂具有广阔的前景空间，应当对万寿菊进行合理应用对万寿菊非花部位进行合理利用，避免资源浪费。

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（收稿日期：2019-07-03  本文编辑：刘永巧）