含挥发油饮片标准汤剂探讨研究——以紫苏叶为例＊

张开雪 ，邬 兰 ，韩宗贤 ，鹿江南 ，马 伟 ，熊超，丁丹丹，陈士林＊＊

（1. 中国中医科学院中药研究所 北京 100700；2. 黑龙江中医药大学药学院 哈尔滨 150040；3. 武汉理工大学化学化工与生命科学学院 武汉 430070；4. 江阴天江药业有限公司 无锡 214434）

紫苏叶来源为唇形科紫苏Perilla frutescens(L.)Britt.的干燥叶（或带嫩枝）[1]，出自《名医别录》，并被列为中品。除了叶，紫苏的果实和茎也可入药。紫苏具有强生命力，对环境要求不高，全国分布广泛，种植历史已超2000年，在日本、韩国、印度、美国、加拿大等国家也有分布，而且很多地区已实现了大范围的商业栽培。

目前，由于其富含独特的活性物质和营养成分，紫苏已经成为一种全世界人民关注的焦点植物。紫苏叶是临床上使用频率较多的中药，同时它也常被作为蔬菜食用，含有多种维生素及矿物质。另外，紫苏叶中还含有挥发油，相关研究证明挥发油具有抗癌、抗氧化、抗菌等作用[1-4]。如今，紫苏叶挥发油不仅在医药、食品行业得到广泛应用，而且在化妆品、营养保健、工业用油、香料工业等方面也取得了一定的成绩，具有很高的开发价值和利用价值[3,5]。《中国药典》2015年版也把紫苏叶挥发油含量作为药材质量控制的指标。截止到今天，类似于紫苏叶挥发油的研究已经有了大量的文献报道[6-7]，但是与紫苏叶水提液相关的研究报道并不常见。汤剂是我国古代最传统的、最常用的且应用最广泛的一种用药方式，临床上治疗疾病也多用汤剂。标准汤剂的引入有利于临床用药的准确性和剂量的统一性，改变目前的监管困局，改善管理水平，保障临床疗效，促进用药质量的提高，促进制造工艺的提升，为中药研究的标准化提供依据[8-11]。因此，开展紫苏叶标准汤剂质量评价方法的研究是有必要的。本文以17批紫苏叶为原料，参考含挥发油饮片桂枝[12]、姜黄[13]、肉桂[14]的标准汤剂研究，按照统一的标准制备紫苏叶饮片标准汤剂，以紫苏叶挥发油的含量为指标，确定转移率和出膏率的范围，测定pH 值，并通过HPLC 法建立紫苏叶标准汤剂的指纹图谱分析方法，寻找最适合紫苏叶标准汤剂的定量指标成分，为紫苏叶标准汤剂质量标准的制定提供参考数据。

表1 紫苏叶样品信息

1 材料

1260 型高效液相色谱仪（安捷伦科技（中国）有限公司）；Sartorius-BP211D 型电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；YP6001型电子天平（上海佑科仪器仪表有限公司）；FE20 型pH 计（瑞士METTLER-TOLEDO 公司）；Scanspeed mini 型高速离心机（丹麦Labogene公司）。

样品来自5 个地区，分别为江苏、河北、江西、河南和浙江，共计17批。经中国中医科学院中药研究所孙伟副研究员鉴定和DNA 条形码实验证实，所有样品均为唇形科植物紫苏Perilla frutescens(L.) Britt（.表1）。咖啡酸对照品（批号MUST-17032010，含量 ≥99.48%），迷迭香酸对照品（批号MUST-17040532，含量 ≥99.40%），野黄芩苷对照品（批号MUST-17030406，含量≥98.74%），且以上对照品全部从成都曼思特生物科技有限公司购买。实验中所用乙腈为色谱纯（Thermo Fisher公司），水为超纯水，其它试剂均为分析纯。

表2 紫苏叶挥发油转移率计算结果（）

表2 紫苏叶挥发油转移率计算结果（）

images/BZ_22_349_1572_437_1609.png/%87.20±11.84编号ZSY-01 ZSY-02 ZSY-03 ZSY-04 ZSY-05 ZSY-06 ZSY-07 ZSY-08 ZSY-09 ZSY-10 ZSY-11 ZSY-12 ZSY-13 ZSY-14 ZSY-15 ZSY-16 ZSY-17饮片中挥发油含量/%（mL·g-1）1.00 1.00 1.00 0.30 0.40 0.40 0.80 1.20 0.50 0.80 0.60 0.50 0.30 0.80 0.80 0.90 1.00标准汤剂中挥发油含量/%（mL·g-1）1.00 0.80 0.80 0.30 0.40 0.40 0.70 1.00 0.40 0.50 0.60 0.40 0.30 0.75 0.70 0.70 0.70转移率/%100.00 80.00 80.00 100.00 100.00 100.00 87.50 83.30 80.00 62.50 100.00 80.00 100.00 93.75 87.50 77.78 70.00

2 方法与结果

2.1 定量测定

2.1.1 供试品溶液的制备

（1）饮片供试品溶液制备

根据《中国药典》2015 年版挥发油测定法（通则2204）测定，取 ZSY-01 至 ZSY-17 紫苏叶饮片适量，保持微沸2.5 h，即得。

（2）标准汤剂供试品溶液制备

参照含挥发油饮片桂枝[12]、姜黄[13]、肉桂[14]的标准汤剂制备工艺，结合陈士林老师2016 年发表的“中药饮片标准汤剂研究策略”一文中对于花叶类饮片制备方法的叙述，最终确定具体提取工艺如下。称100 g紫苏叶，置圆底烧瓶中，加12 倍量水浸泡30 min，在挥发油提取器中提取2 h，得挥发油，提取液过滤；向余下的残渣中再加入10倍量水，在挥发油提取器中继续提取30 min，得挥发油，提取液过滤。将两次得到的挥发油合并、提取液合并，待提取液浓缩至适量后，再将挥发油加入其中，定容至500 mL，即得标准汤剂供试品溶液。

2.1.2 测定法

分别测定饮片供试品溶液和标准汤剂供试品溶液中所得挥发油的量（表2）。

表3 紫苏叶标准汤剂pH值及出膏率

2.2 转移率和出膏率

2.2.1 挥发油转移率

基于饮片中挥发油的含量测定结果和标准汤剂中挥发油的含量测定结果，计算紫苏叶的挥发油转移率（表2）：转移率（%）= W·M-1*100%，W 表示汤剂中挥发油的量（mL），M 表示饮片中挥发油的量（mL）。挥发油转移率范围为62.50%-100.00%，平均值为87.20，RSD值为13.58%。

2.2.2 出膏率

取干燥至恒重的蒸发皿，精密加入“2.1.1（2）”项下标准汤剂供试品溶液各25 mL，平行两份，水浴蒸干，在105℃烘箱中干燥3 h，移置干燥器中，冷却30 min，称重，计算得到紫苏叶标准汤剂的出膏率，其中出膏率范围为14.50%-24.80%（表3）。

2.3 pH值测定

取“2.1.1（2）”项下标准汤剂供试品溶液适量，用pH 计测定 pH 值，得到 pH 范围在 4.70-5.25 之间，平均值为4.90，RSD值为2.7%，波动不大（表3）。

2.4 紫苏叶标准汤剂指纹图谱

2.4.1 色谱条件

色谱柱：Aligent-Eclipse Plus C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）。流动相：0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脱条件：0-50 min，12%-19%B；50-60 min，19-22% B。柱温：30℃；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：325 nm。

2.4.2 标准汤剂供试品溶液的制备

精密量取紫苏叶标准汤剂供试品溶液0.8 mL和水0.8 mL，置于同一离心管中，混匀，12000 rpm离心5 min，取上清液用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4.3 对照品溶液制备

取咖啡酸、野黄芩苷和迷迭香酸对照品适量，精密称定，加甲醇配制成浓度均为20 μg·mL-1的混合对照品溶液，即得。

2.4.4 测定法

精密吸取17批次的标准汤剂供试品溶液各10 μL、混合对照品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。

2.4.5 方法学验证

（1）精密度实验

取批号为ZSY-01 的样品制备的紫苏叶标准汤剂供试品溶液，按2.4.1 项下色谱条件连续进样6 次，以7号峰作为参照峰，对主要共有峰的相对峰面积和相对保留时间进行测定。结果表明RSD 均＜2%，表明仪器精密度良好。

（2）重复性实验

取批号为ZSY-01 的样品平行制备6 份紫苏叶标准汤剂供试品溶液，按2.4.1 项下色谱条件进样，以7号峰作为参照峰，对主要共有峰的相对峰面积和相对保留时间进行测定。其结果显示RSD 均＜2%，表明本方法重复性良好。

（3）稳定性试验

取批号为ZSY-01 的样品制备紫苏叶标准汤剂供试品溶液，分别在制备后0、2、4、6、8、10、12、24 h 进行测定，按2.4.1 项下色谱条件进样，以7 号峰作为参照峰，对主要共有峰的相对峰面积和相对保留时间进行测定。结果显示RSD 均＜2%，表明紫苏叶标准汤剂供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.4.6 指纹图谱的建立及共有峰的标定

精密吸取17批次的紫苏叶标准汤剂供试品溶液，按2.4.1 项下色谱条件进行测定，记录色谱峰信息（见图1）。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）”软件对所得到的17 批指纹图谱进行分析，生成对照指纹图谱，结果表明17批紫苏叶标准汤剂的指纹图谱与对照指纹图谱间相似度均超过0.8（表4），发现共有峰有7 个，通过对照品指认出3 个共有峰，其中 1 号峰：咖啡酸，6 号峰：野黄芩苷，7 号峰：迷迭香酸，以7 号峰作为参照峰，得到7 个共有峰的相对保留时间和相对峰面积（表5）。

图1 17批紫苏叶标准汤剂的HPLC指纹图谱

2.4.7 标准汤剂中共有峰的含量测定

根据2.4.4 项下测定结果，得到17 批紫苏叶标准汤剂中咖啡酸含量范围为53.71-209.85 μg·mL-1，野黄芩苷的含量范围为144.62-1985.16 μg·mL-1，迷迭香酸的含量范围为121.08-1465.46 μg·mL-1（表6）。

2.5 紫苏叶标准汤剂中定量指标成分探讨

《中国药典》2015 年版紫苏叶饮片项下仅规定了挥发油的含量，并没有规定某一种确定的指标成分，因此需要寻找适合紫苏叶标准汤剂的指标成分来用于定量研究。基于此，对指纹图谱中已指认的三个共有峰通过对照品进行初步定量计算，本研究中选择迷迭香酸作为定量控制指标成分，所研究的17批紫苏叶标准汤剂中迷迭香酸含量为121.08-1465.46 μg·mL-1，可用于紫苏叶标准汤剂定量控制。

3 讨论

《中国药典》2015 年版收载了紫苏子、紫苏梗和紫苏叶三种药材，它们的来源均为唇形科植物紫苏，只是取自其原植物紫苏Perilla frutescens（L.）Britt.的三个不同药用部位，分别为果实、茎、叶。当中还规定迷迭香酸是紫苏子药材、饮片和紫苏梗药材的指标成分；紫苏叶药材和饮片都规定了挥发油含量限定，没有规定具体的指标成分。对于紫苏叶标准汤剂仅以挥发油含量作为是否合格的标准较为单一，缺乏对其主要成分的定性分析，所以本文对紫苏叶标准汤剂的指纹图谱进行研究并指认了部分共有峰。以特征峰个数多和峰形好为依据，通过DAD 全波长扫描实验，最终确定指纹图谱检测波长为325 nm，并在此波长下指认出3 个成分：咖啡酸，野黄芩苷，迷迭香酸。迷迭香酸是药典规定的紫苏子药材和饮片以及紫苏梗药材的质控指标，并不是紫苏叶所特有的成分，在其他药材，如夏枯草和薄荷中也含有迷迭香酸这一成分，因此是否选择迷迭香酸作为紫苏叶的质控指标是需要讨论的。由于迷迭香酸在紫苏叶标准汤剂中含量相对较高，稳定性佳，也是其发挥药效的活性成分[4]，因此暂定为紫苏叶标准汤剂的质量控制指标成分。待未来进行更深入的研究后可建议增加新的指标成分，如指纹图谱中的其他成分如野黄芩苷等。

表4 17批紫苏叶标准汤剂指纹图谱相似度匹配

表5 紫苏叶标准汤剂共有峰的相对保留时间与相对峰面积

标准汤剂质量控制主要从定性和定量两方面着手，定量包括了指标成分转移率、汤剂出膏率、pH等参数；定性则为控制整体成分的指纹图谱。指标成分是基于药典指标，具有法定效力，通过计算指标成分转移率，可明确有效成分传递规律；出膏率是标准汤剂整体成分的反映。通过出膏率既可以反映已知成分，又可以反映未知成分[15]。此外，出膏率还可为后续的配方颗粒成品量提供参考数据。pH 可以作为辅助参考。指纹图谱不仅能反应标准汤剂的主要化学成分，还能有效反应配方颗粒等失去中药外表特征的中药制剂的主要化学成分，这一方法的出现为紫苏叶标准汤剂质量标准提供参考。

紫苏叶含有挥发油，为了更好的保留这类成分，测定这类药材时，需要将其单独提取出来，参考含挥发油饮片-桂枝，姜黄，肉桂标准汤剂制备中挥发油的提取工艺，即采用挥发油提取器提取挥发油，头煎2 h，二煎0.5 h，而后将提取到的紫苏叶挥发油兑入浓缩的汤剂中。药典中明确规定紫苏叶饮片挥发油含量最少为0.20%（mL·g-1），本研究以5个产地不同规格等级的17批紫苏叶饮片为研究对象，测得紫苏叶饮片的挥发油含量为0.30-1.20%（mL·g-1），紫苏叶标准汤剂的挥发油含量为0.30-1.00%（mL·g-1），挥发油转移率为87.20±11.84%，该数值说明紫苏叶标准汤剂挥发油转移率较高。

表6 紫苏叶标准汤剂中3个共有峰的含量结果

本文以17 批不同产地的紫苏叶标准汤剂为研究对象，建立紫苏叶标准汤剂的质量评价方法，经测定，17 批紫苏叶饮片挥发油含量均符合药典规定的要求，但是不同批次间挥发油含量还是存在很大差异。所得紫苏叶标准汤剂的出膏率范围为14.50%-24.80%，挥发油的转移率范围为62.50%-100.00%，pH 值范围为4.70-5.25。经“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）”软件进行色谱峰匹配，结果表明17 批紫苏叶标准汤剂指纹图谱相似度相对较高，均大于0.8，确定共有峰7 个，指认3 个。咖啡酸的含量范围为53.71-209.85 μg·mL-1，野 黄 芩 苷 的 含 量 范 围 为144.62-1985.16 μg·mL-1，迷 迭 香 酸 的 含 量 范 围 为121.08-1465.46 μg·mL-1，建立的紫苏叶标准汤剂的质量评价方法可为紫苏叶标准汤剂质量标准的制定提供参考数据。