白藜芦醇对小鼠结肠运动的抑制作用和机制研究

杨 梦 ，陆红丽，黄 旭，许文燮

1. 荆楚理工学院医学院生理教研室，荆门448000；2. 上海交通大学基础医学院解剖与生理学系，上海200240

白藜芦醇（resveratrol，Res），又称为3, 4', 5-三羟基-反式-二苯乙烯，是一种天然的多酚化合物，存在于花生、葡萄、桑葚等多种植物之中。Res具有保护心血管[1-4]、抗癌、抗衰老、抗菌消炎等作用[5-7]。研究表明，Res是一种植物雌激素，可以舒张血管平滑肌[8]、胃、十二指肠[9-10]和胆囊[11]；在不同的平滑肌组织中，Res的作用机制并不一致；而有关Res对结肠运动的作用和机制尚未见报道。

结肠运动是结肠传输的动力。在哺乳动物中，结肠移行性复合运动（colonic migrating motor complex，CMMC）是粪便排出的主要推进性收缩[12]。CMMC是一种复杂的生理活动，受肠神经和2种间质细胞［即Cajal间质细胞（interstitial cells of Cajal，ICC）和血小板衍生生长因子受体α阳性细胞（platelet-derived growth factor receptor α-positive cells，PDGFRα+细胞）］的共同调节[13-15]。而且，结肠平滑肌的收缩与平滑肌细胞上的K+通道和电压依赖性Ca2+通道密切相关[16-19]。

结肠运动障碍引起结肠功能紊乱，可见于多种疾病。在治疗中，一些化学药物的不良反应十分明显，所以越来越多的研究集中在低毒性的天然来源的植物化学物质。而且，Res存在于多种食物之中，研究其对胃肠道运动的作用，尤其对结肠运动的作用，具有重要的生物医学意义。本研究旨在阐明Res对小鼠结肠运动的作用和机制，以期为Res的临床开发和应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验仪器 SZX12型解剖显微镜、IX-70倒置显微镜（日本Olympus Optical公司），JZJ01H型张力换能器、RM6240系列多通道生理信号采集处理系统（中国成都仪器厂），P97微电极拉制仪（美国Sutter公司），EPC-10膜片钳放大器（德国HEKA公司）。

1.1.2 试 剂 Res、Bayk8644、apamin、 四 乙 基 铵（tetraethylammonium，TEA）、河豚毒素（tetrodotoxin，TTX）、Nω-硝 基 -L-精 氨 酸 甲 酯（Nω-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME）、阿托品和5-硝基-2-（3-苯基丙基氨基）苯甲酸[5-nitro-2-（3-phenylpropylamino）benzoic acid，NPPB]均购自美国Sigma公司。

1.1.3 动物 4～5周的成年雄性ICR（Institute of Cancer Research，美国癌症研究所）小鼠由中国科学院上海实验动物中心提供［生产许可证号为SCXK（沪）2018-007，使用许可证号为SYXK（沪）2018-0027］，在20～25 ℃下饲养，饮食不限制。研究经上海交通大学医学院动物实验伦理委员会审批。

1.2 实验方法

1.2.1 结肠平滑肌自发性收缩的记录 实验前1日配置溶液和药品。Krebs溶液：葡萄糖 11.5 mmol/L，CaCl22.5 mmol/L，NaCl 121.9 mmol/L，NaHCO315.5 mmol/L，KCl 5.9 mmol/L，MgSO41.2 mmol/L，KH2PO41.2 mmol/L。将Res、Bayk8644和NPPB溶解在二甲基亚砜中。将apamin、TEA、TTX、L-NAME、atropine溶解于双蒸水。所有药物均保持在-20 ℃。用异氟烷麻醉并脱颈处死小鼠，将结肠迅速取出、移至氧饱和的Krebs溶液。在解剖显微镜下，除去黏膜和黏膜下层，将结肠平滑肌组织切成小条（2 mm×8 mm）。使用丝线系住两端，将肌条的一端固定在38 ℃、氧饱和的10 mL浴槽溶液中，另一端连接张力换能器，换能器与多通道生理信号放大器相连，通过电脑记录肌条的自发性收缩[20]。首先使用8只小鼠，观察 Res（10、20、40和 80 μmol/L）对肌条的作用，对比同一肌条在Res处理前后的自发性收缩。然后观察各种阻断剂或激动剂对Res作用的影响。具体如下：先观察记录Res对肌条的作用，洗脱之后用各种阻断剂或激动剂预处理肌条，再观察记录Res对肌条的作用。对比同一肌条预处理前后Res的作用。各阻断剂或激动剂预处理所用的小鼠例数如下：L型Ca2+通道激活剂BayK8644（n=4）、非选择性K+通道阻滞剂TEA（n=9）、Na+通道阻滞剂TTX（n=8）、胆碱能神经元抑制剂阿托品（n=5）、NO合酶抑制剂L-NAME（n=10）、ANO1（anoctamin 1）通道抑制剂NPPB（n=4）和SK3通道抑制剂apamin（n=6）。

1.2.2 CMMC的记录 用异氟烷麻醉并脱颈处死小鼠（n=6），迅速取出结肠放入氧饱和的Krebs溶液。在解剖显微镜下切除肠系膜，用1 mL注射器人工排出粪便颗粒，并将与模拟粪便颗粒连接的玻璃毛细管插入肠管。之后，移入矩形容器，其中充满20 mL温度为（38.0±0.5）℃、氧饱和的Krebs溶液；将结肠固定在硅胶板底部，将丝线连接到结肠的近端和远端，通过张力换能器连接到放大器装置[21]。通过电脑记录Res对CMMC的作用，记录和对比同一离体结肠经Res处理前后的远端和近端CMMC。

1.2.3 结肠平滑肌细胞的分离 实验前1日配置无钙生理盐水：NaCl 134.8 mmol/L，KCl 4.5 mmol/L，葡萄糖 5 mmol/L，MgCl2· 6H2O 1 mmol/L，HEPES 10 mmol/L， 用 Tris 调 节至pH 7.40。用异氟烷麻醉并脱颈处死小鼠，迅速取出结肠放入氧饱和的无钙生理盐水。在显微镜下，除去黏膜和黏膜下层，将肌肉层切成小段（1 mm×4 mm），放入装有无钙生理盐水的试管中，保持在4 ℃。然后配置消化液：在1 mL 无钙生理盐水中加入Ⅱ型胶原酶4 mg、胰蛋白酶抑制剂8 mg、牛血清白蛋白8 mg、二硫苏糖醇2 μmol、木瓜蛋白酶2 μmol，保持在4 ℃，备用。之后将肌条放入装有1 mL消化液的试管中，在37.5 ℃下消化20～30 min，然后用无钙生理盐水多次洗涤肌条，保持在4 ℃，备用[22]。

1.2.4 电生理记录 实验前1日，配置记录钡电流（barium currents，IBa）的灌流液：NaCl 134.8 mmol/L、KCl 4.5 mmol/L、 葡萄糖 10 mmol/L、MgCl2·6H2O 1 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、BaCl210 mmol/L， 用 Tris调 节 至pH 7.40；配置记录IBa的电极内液：CsCl 125 mmol/L、TEA 20 mmol/L、EGTA 10 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、Na2ATP 2 mmol/L、MgCl2· 6H2O 4 mmol/L， 用 Tris调 节至pH 7.35。用平滑玻璃口的滴管反复吹打肌条（n=6），直至溶液浑浊，形成平滑肌细胞悬浮液。从试管中取悬浮液平铺于倒置显微镜的灌流槽中，10～15 min之后开始灌注。实验在20～25 ℃进行，玻璃电极的电阻为2～4 MΩ，采用膜片钳技术的全细胞记录模式，用膜片钳放大器记录L型Ca2+电流细胞[23]。

1.3 统计学方法

使用Origin 7.5软件分析数据，数据以±s表示。使用单因素方差分析（one-way ANOVA with Bonferroni's post hoc test）评估多组数据，并使用t检验比较配对的2组数据。P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Res对小鼠离体结肠平滑肌自发性收缩和CMMC的影响

Res以剂量依赖的方式显著抑制小鼠离体结肠平滑肌自发性收缩，10、20、40和 80 μmol/L Res分别抑制收缩幅度 至（86.08±4.43）%、（67.46±4.12）%、（40.59±5.64）%和（17.42±3.78）%（均P＜0.05，图1A、C）。Res显著抑制小鼠离体结肠近端和远端的CMMC至（63.13±14.82）%和（61.23±5.18）%（P=0.031，P=0.001，图 1B、D）。

图1 Res对小鼠离体结肠自发性收缩和CMMC的影响Fig 1 Effects of Res on colonic spontaneous contraction and CMMC in mice

2.2 肠神经系统和2种间质细胞在Res抑制结肠平滑肌自发性收缩中的作用

施用TTX前后，Res分别抑制收缩幅度至（56.75±5.27）%和（49.27±8.94）%（图2A、D）；施用atropine前后，收缩幅度被抑制到（75.06±9.38）% 和（71.19±10.22）%（图2B、E）；施用L-NAME前后，收缩幅度被抑制至（52.43±5.64）% 和（44.68±7.08）%（图 2C、F）。与 Res单独作用组相比，抑制剂+Res组收缩幅度无明显变化（P＞0.05），说明3种抑制剂均不能显著阻断Res对结肠平滑肌自发性收缩的抑制作用。

图2 TTX、atropine和L-NAME对Res抑制小鼠结肠自发性收缩的影响Fig 2 Effects of TTX, atropine and L-NAME on Res-suppressed colonic spontaneous contraction in mice

施用apamin前后，收缩幅度分别被Res抑制至（42.38±6.38）% 和（46.51±3.49）%（图 3A、C）；施用NPPB前后，收缩幅度分别被Res抑制至（58.39±6.23）%和（49.31±14.76）%（图3B、D）。与Res单独作用组相比，抑制剂+Res组收缩幅度无明显变化（均P＞0.05），说明这2种抑制剂也不能显著阻断Res对结肠平滑肌自发性收缩的抑制作用。

图3 Apamin和NPPB对Res抑制小鼠结肠自发性收缩的影响Fig 3 Effects of apamin and NPPB on Res-suppressed colonic spontaneous contraction in mice

2.3 离子通道阻断剂在Res抑制结肠平滑肌自发性收缩中的作用

用TEA预处理前后，收缩幅度分别被Res抑制至（43.89±8.08）% 和（59.93±4.77）%（图 4A、C），差异无统计学意义（P＞0.05），提示非选择性K+通道阻滞剂TEA对Res的抑制作用没有影响。

用BayK8644预处理前后，结肠平滑肌自发性收缩被Res抑制至（44.09±13.41）%和（84.56±6.09）%；与Res单独作用组相比，BayK8644+Res组中Res的抑制作用明显被阻断（P=0.031，图4B、D），提示L型Ca2+通道激活剂BayK8644可显著阻断Res的抑制作用。

图4 TEA和BayK8644对Res抑制小鼠结肠自发性收缩的影响Fig 4 Effects of TEA and BayK8644 on Res-suppressed colonic spontaneous contraction in mice

2.4 Res对L型Ca2+通道电流的影响

在新鲜分离的结肠平滑肌细胞上，在传统的全细胞模式下，将膜电位钳制在-80 mV，每10 s给予10 mV增加幅度的阶跃刺激，使其去极化依次从-40 mV至70 mV，时间持续440 ms，记录IBa。在I-V关系曲线（current-voltage relation curve）中，从-20 mV至50 mV，40 μmol/L Res显著降低 IBa（均P＜0.05，图 5A、B）；在0 mV时，IBa被抑制至（35.92±6.88）%（图5C）。

图5 Res对L型Ca2+电流的影响Fig 5 Effect of Res on L-type Ca2+ current

3 讨论

在本研究中，Res显著抑制结肠平滑肌的自发性收缩和CMMC；Res对结肠平滑肌自发性收缩的抑制作用不受TTX、atropine、L-NAME、NPPB、apamin、TEA的影响，却被 BayK8644显著阻断且Res直接抑制结肠平滑肌细胞的L型Ca2+通道电流。这些结果表明，Res对结肠平滑肌运动的抑制作用可能通过L型Ca2+通道介导。

正常情况下结肠运动受肠神经调节，主要包括兴奋性的胆碱能神经[13]和抑制性的氮能和嘌呤神经[14]。报道的Res的作用机制在不同平滑肌的组织中存在差异。Res能舒张大鼠胃和十二指肠、豚鼠胃底平滑肌和人胆囊，与NO通路有关[9-11]；但是Res舒张血管的作用与NO通路无关[8]。因此，在本研究中，我们首先研究了Res的抑制作用是否与肠神经系统有关，分别使用TTX来阻断肠神经系统、阿托品阻断胆碱能神经、L-NAME（NO合酶抑制剂）来阻断平滑肌的NO合成；结果发现Res的抑制作用不受这些药物的影响。继而表明，Res对结肠的抑制作用可能与神经系统没有关系。

除了神经系统，结肠运动还受2种间质细胞的调节。ICC 是胃肠平滑肌自动节律性运动的起搏细胞，其上表达的ANO1通道产生起搏电流，使平滑肌去极化产生慢波，并激活平滑肌细胞L型Ca2+通道产生快波，引起平滑肌收缩[24]；SK3通道在PDGFRα+细胞上高表达，而在ICC和平滑肌细胞上表达量则非常少[25]，SK3通道被激活会引起PDGFRα+细胞的超极化，又通过缝隙连接使相邻的平滑肌超极化，抑制平滑肌L型Ca2+通道，引起平滑肌舒张[24]。为研究Res的抑制作用是否与2种间质细胞有关，我们分别用NPPB阻断ANO1通道、apamin阻断SK3通道，结果发现Res的抑制作用不受影响，继而说明Res对结肠的抑制作用可能与2种间质细胞无关。

平滑肌的收缩性与平滑肌细胞膜上的离子通道密切相关。K+通道在维持静息膜电位和平滑肌松弛方面起重要作用[16-17]。平滑肌细胞中有3种外向钾电流，即延迟整流钾电流（IKV）、钙激活钾电流（IKCa）和瞬时外向钾电流（Ito）[26]。Wade等[17]证明IKV在调节食管肌肉静息张力方面起主导作用，而IKCa在很大程度上限制了与激发相关的收缩。此外，ATP依赖性K+通道参与慢波的形成，并参与硫化氢对胃肠和血管平滑肌的抑制[18,27]。据报道[9-11]，Res对大鼠胃和十二指肠、豚鼠胃底平滑肌和人胆囊的舒张作用与ATP敏感性K+通道有关，对人胆囊的舒张作用还与大电导钙激活K+通道通路有关。在我们的实验中，TEA（非选择性K+通道阻滞剂）不能阻断Res的抑制作用，说明K+通道可能没有参与Res对小鼠结肠的抑制作用。

胃肠平滑肌的快波形成和肌肉收缩均由钙内流引起，Ca2+通道的开放和膜电位相关联，是电压依赖性Ca2+通道[19]，其可分为L型和T型等。与T型相比，L型电压依赖性Ca2+通道有以下特点：高阈值、大电导；失活慢，开放时程长；当用Ba2+代替细胞外Ca2+时，L型Ca2+电流幅度增大，而T型Ca2+电流不受影响；L型对BayK8844敏感，而T型对其不敏感[28]。在动作电位期间，细胞外Ca2+离子主要通过L型Ca2+通道进入平滑肌细胞而引起收缩。L型是胃肠道平滑肌细胞膜中主要的电压依赖性Ca2+通道[19]。据报道，Res通过抑制L型Ca2+通道而舒张兔主动脉、大鼠的胃和十二指肠[15-16]。在本研究中，Bayk8644（L型 Ca2+通道激活剂）可显著阻断Res对结肠平滑肌自发性收缩的抑制作用。为进一步证实Res的抑制作用与L型Ca2+通道有关，我们使用全细胞膜片钳技术，观察Res对新鲜分离的结肠平滑肌细胞上L型Ca2+通道电流的影响，发现在I-V曲线中，从-20 mV到50 mV Res可显著抑制IBa。这些结果表明Res可能通过直接抑制L型Ca2+通道电流来抑制结肠平滑肌运动。

综上所述，本实验中Res显著抑制小鼠的结肠运动，其机制可能与结肠平滑肌细胞L型Ca2+通道的抑制有关，而肠神经系统、NO信号通路、2种间质细胞和K+通道可能不参与Res的抑制作用。