粪便钙卫蛋白检测在野生大熊猫肠道疾病诊断中的应用

唐流斌，何念军，赵凯辉，孙 亮 ，文一帆，金艺鹏*

(1.陕西佛坪国家级自然保护区，陕西 佛坪 723400；2.中国农业大学动物医学院，北京 100193)

大熊猫隶属于食肉目熊科大熊猫属，是我国特有物种，被称为“国宝”。现存的大熊猫种群主要分布于我国中西部四川盆地西、北边缘及相邻的秦岭南缘的陕南、甘南地区六个相互隔离的山系中[1]，可分为四川种群和秦岭种群[2]。目前，得益于我国的一系列政策的支持和保护力度的加强，大熊猫种群数量在历次调查中稳步上升[3-4]，在IUCN评级中已经由濒危降为易危[5]。

大熊猫主要以竹子为食，其食物组成中99%为竹子[6]。竹子粗纤维含量很高，大熊猫无法通过自身的转录翻译功能产生纤维素酶来对粗纤维进行消化。早期的研究发现，大熊猫肠道微生物中有协助大熊猫降解纤维素的基因[7]，可以将竹子中富含的多聚糖转换为单糖、二糖而被大熊猫利用吸收[8-11]。尽管如此，大熊猫还是不能完全消化这些食物，竹子(特别是竹竿)在经过大熊猫肠道的时候会给肠道很大的负荷。肠道寄生虫是野生大熊猫面临的最大困扰[12-13]，不仅会影响大熊猫的营养吸收，严重的还会引起肠道穿孔和腹膜炎等。早期研究表明肠道寄生虫引起的肠道疾病是野生大熊猫死亡的最重要原因之一[14]。正常生理状态下，大熊猫肠道上皮细胞会分泌大量的黏液协助排便，黏液层具有维持正常调节功能，当杯状细胞分泌的黏液减少，缺乏黏液的小鼠会出现自发性的结肠炎[15]。在前期的野生大熊猫救助工作中，我们发现死亡野生大熊猫的肠道中普遍存在慢性炎症表象。为了评估野生大熊猫健康状况，特别是消化吸收功能，我们亟需一个有效的参考指标对野生大熊猫的肠道疾病进行评估，该指标的建立测量过程需要满足野生大熊猫生活隐蔽、采样困难等的特殊性。

钙卫蛋白(Calprotectin，S100A8/A9)在人体中分布广泛，是中性粒细胞和单核细胞中的主要蛋白质，由两条重链(14 000 KD)和一条轻链(8 000 KD)非共价结合而成的异二聚体[16], 相对分子量约为36 000 KD。在中性粒细胞中，钙卫蛋白约占细胞总蛋白的5%, 存在于溶酶体外的细胞液中, 含量约为5～15 mg·ml-1，为中性粒细胞更新的标志物，在许多炎症情况下都可升高[16]。犬钙卫蛋白S100A8相对分子质量约为10 374.8 KD，S100A9相对分子质量约为14 670.3 KD。钙卫蛋白可以在血清和粪便中检测出，粪便中钙卫蛋白浓度与肠道炎症的严重程度有一定的相关性。例如，在慢性肠炎患犬中，粪便中的钙卫蛋白浓度是血清钙卫蛋白浓度的数倍[17]。同时，在胃肠道急性炎症状态下，粪便中钙卫蛋白浓度也会上升。在一项研究中，急性出血性腹泻综合征(AHDS)的患犬，它们的胃肠道病理结果显示在伴随着血管通透性增加导致的蛋白丢失和出血及炎性浸润情况下，粪便中钙卫蛋白是随病情发展不断变化的[18]。除此以外，胃肠道的肿瘤也会导致钙卫蛋白浓度上升。粪便钙卫蛋白作为一种生物标记物，可以初步检测动物各种胃肠道疾病。通常,以50 μg·g-1为分界线，作为诊断犬慢性肠炎的指标[19]。

1 材料与方法

陕西佛坪国家级自然保护区在距陕西省珍稀野生动物救助与繁育中心157 km的秦岭山脉中，是野生大熊猫分布最集中的地方之一。前期野生大熊猫调查结果显示在佛坪县就有野生大熊猫110～130只，占秦岭大熊猫种群总数的四成以上。本研究中的所有野生大熊猫粪便样本均来源于佛坪国家级自然保护区的三官庙保护站和西河保护站。野生大熊猫粪便样本采样季节主要为冬季(竹叶粪便)和春季(竹笋粪便)，根据粪便表层黏液分布程度，判断样本新鲜程度，所有样本新鲜程度均为1～2 d。发现大熊猫新鲜粪便后，用无菌采样袋装取，采集过程中尽量避免人为带去的粪便完整性破坏，并做好标记，8 h内运回保护站进行处理，运输过程均为冰块冷冻保存，运回保护站后-20 ℃冷冻保存，待分析。

粪便样本在实验室无菌环境下剥离外层2 cm左右的部分，取中心位置的约1 g粪便，装入无菌离心管中，加入10 ml去离子水。充分混匀之后在高速离心机1 000 rpm情况下离心20 min，取上清液待检。剩余液体留存。为了减少粪便样本污染，称量纸等仪器和耗材均经过紫外消毒或者高压蒸汽灭菌处理。用于取样的镊子经高压灭菌，每一次取样之后都使用75%酒精进行反复处理3次。采用酶联免疫吸附剂测定(Enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA)方法进行检测，利用犬钙卫蛋白检测试剂盒。说明书所记录的操作方法进行实验操作。为了减少实验误差，每个样本检测三次，最后取平均值。

从NCBI(National Center for Biotechnology Information Search database)下载包括人、大熊猫、猫和狗等25个物种的S100A8和S100A9氨基酸序列，用Mega 6.0 软件进行序列比对和系统发育树分析。在R 3.5.1(R Core Team, 2015)中进行数据分析，使用T检验来比较两组之间的统计差异，所有检验均为双尾检验P<0.05为差异显著。

2 结果分析

2.1 S100A8和S100A9基因系统发育关系分析

S100蛋白家族基因进化相对保守。S100A8蛋白系统发育树显示(图1 a)，熊科与食肉目的猫科和犬科物种聚集在同一支，结果表明大熊猫S100A8蛋白序列与犬、猫等具有高度相似性。S100A9蛋白系统发育树显示(图1 b)，熊科与猫科动物聚在同一支，而与犬科物种存在一定差异，结果表明大熊猫S100A8蛋白序列与猫等物种具有高度相似性。

图1 S100A8(a)、S100A9(b)进化关系分析

2.2 酶联免疫吸附剂测定标准曲线

对购买的犬钙卫蛋白检测试剂盒用标准样液进行标准曲线绘制，共进行了12次检测(图2)。从标准品检测结果可以看出，吸光度与标准样液浓度成线性相关，测出的标准曲线相对稳定。样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990，呈现良好的线性关系。

图2 酶联免疫吸附剂测定检测标准曲线

2.3 大熊猫采食竹叶和竹笋期钙卫蛋白浓度变化

本研究共采集野生大熊猫粪便样本23份，其中大熊猫采食竹笋期样本6份，采食竹叶期样本17份。用犬钙卫蛋白检测试剂盒对所有样本进行检测，每个样本检测3次，测量后得出平均值。粪便测量值误差稳定在10%以内，同一批检测试剂盒板间与板内变异系数在10%以内。对大熊猫采食竹叶和竹笋不同时期的钙卫蛋白浓度进行比较，结果分析表明大熊猫在采食竹叶期粪便(64.86 ± 2.37 ng·ml-1)中钙卫蛋白的浓度显著高于采食竹笋期(23.79±4.92 ng·ml-1)(t=7.50,df=7.73,p<0.05)(图3)。

图3 大熊猫采食竹叶和竹笋时钙卫蛋白浓度变化

3 讨论

在临床研究中，使用了很多方法对炎症指示物例如IL-6、IL-8等进行了检测，其中，使用酶联免疫吸附剂测定方法在检测方面的变异系数在可接受的2.95%～9.8%[20]，考虑到本研究所需要的条件，可以说酶联免疫吸附剂测定方法是最适合的方式。同时，钙卫蛋白在环境中的稳定性在研究中得到证实，在约23 ℃的室温条件下，犬钙卫蛋白在两周以内能够稳定存在[21]。在低温状态下，其能稳定存在的时间更长，人钙卫蛋白在2～8 ℃下保存10 d，-20 ℃下能保存1 a，并且能经受4次冻融过程。鉴于野外采集新鲜大熊猫粪便的难度，大熊猫粪便中的钙卫蛋白是适合监测野生肠道疾病的良好指标。

我们利用进化发育关系对大熊猫和其它不同物种进行分析，结果表明大熊猫钙卫蛋白与犬钙卫蛋白具有同源性，可以利用犬钙卫蛋白ELISA检测试剂盒对大熊猫钙卫蛋白进行检测。检测结果发现，同样处理下的大熊猫粪便钙卫蛋白检测值均在试剂盒准确检测的范围内。尽管如此，大熊猫钙卫蛋白与犬或猫中钙卫蛋白仍存在一定差异，后期研究中或者应该可以考虑利用大熊猫特异性的试剂盒进行检测。

本研究中尽管大熊猫粪便样本数量有限，但是在比较野生大熊猫采食不同食物期间粪便钙卫蛋白浓度发现，竹叶粪便样本钙卫蛋白检测值要显著高于笋期。这种现象的主要原因可能有两种：(1)采食竹叶期间，竹叶较为粗糙，大熊猫肠道可能存在一定的损伤，更容易引发炎症；(2)竹笋粪便水分较多，可能对钙卫蛋白浓度存在一定稀释作用。遗憾的是本研究未得到有明显肠道炎症症状大熊猫的粪便样本，所以无法对比正常状态与病理情况下野生大熊猫粪便钙卫蛋白的含量变化。野生大熊猫粪便样本获取难度很大，尤其是病理情况下的样本，这需要在今后的研究中对所需要样本进行长时间的积累。